İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Homojenizasyon
NOT: Tüm adımlar 4 °C'de gerçekleştirilir.
- 200 μM PTU ile muamele edilmiş 50 mL E3 embriyo ortamında 50 larva içeren 90 mm Petri kabına 1.5 mL Trikain (15 mM) ekleyin ve bunları terminal anesteziye tabi tutun.
- Petri kaplarından 10 anestezi uygulanmış larvayı 3 mL Pasteur plastik dökme pipet ile emdirin.
- Anestezi uygulanmış larvaları 10'a 10'luk bir şekilde, buz gibi soğuk E3 embriyo ortamı + Trikain ile doldurulmuş 55 mm'lik bir Petri kabına aktarın.
- Stereomikroskop altında, Petri kabının ortasına 10 larva hizalayın. Ardından, cerrahi mikro makas kullanarak larva başlarını yumurta sarısı kesesinin üzerinden geçirin (yüzen kafaları önlemek için yüzme kesesini hariç tutun).
- 3 mL Pasteur plastik dökme pipet ile Petri kaplarından kafaları emdirin. Tüm başlıklar pipet ucunda toplanana kadar bekleyin ve ardından bunları 1 mL buz gibi soğuk Ortam A içeren bir cam homojenizatöre aktarın (Ortam A'nın E3 + Trikain ile seyreltilmesini azaltmak için minimum hacimde aktarın). Cam homojenizatörü buz üzerinde tutun. Deney koşulu başına bir homojenizatör kullanın.
- Buz gibi soğuk E3 + Trikain içeren her küçük Petri kabını her 30 dakikada bir yenisiyle değiştirin ve transeksiyonun soğuk E3 + Trikain ortamında yapıldığından emin olun.
- Renk solmaya başladığında cam homojenizatördeki buz gibi Ortam A'yı değiştirin.
NOT: Ortam A seyreltmesi, sıcaklık değişiklikleri nedeniyle kafa dokusunu değiştirebilir.
- Tüm başlıklar toplandıktan sonra (600 kafa/durum), cam homojenizatörden maksimum Ortam A hacmini çıkarın ve 1 mL taze buz gibi soğuk Ortam A ile değiştirin.
- Buz üzerinde sıkı bir cam homojenizatör ile beyin dokusunu bozun. 3-5 dpf larvaları için 40 tur kırma ve dönüş ve 7 ve 8 dpf larvaları için 50 tur kırma ve dönüş gerçekleştirin.
- Hücre süspansiyonuna (1 mL Media A/200 kafa) 2 mL Media A ekleyin, bu da hücreleri seyreltecek ve yoğunluk gradyan ortamında santrifüjleme sırasında ayrılmalarını kolaylaştırmak için miyelin ile aglomerasyonlarını azaltacaktır.
- Hücre aglomerasyonunu ortadan kaldırmak için, hücre süspansiyonunu buz üzerinde tutulan 50 mL'lik soğuk bir şahin tüpünün üzerine yerleştirilmiş 40 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin. Bu işlemi 3 kez tekrarlayın.
- 1 mL hücre süspansiyonunu soğuk 1.5 mL'lik tüplere aktarın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 g'da döndürün.
- 10 mL şırınga + iğne 23G x 1 '' kullanarak süpernatanı çıkarın.
- Hücre peletini 1 mL buz gibi %22 yoğunluk gradyan ortamı ile 0,5 mL buz gibi soğuk DPBS 1x ile hafifçe kaplanmış olarak yeniden süspanse edin (bunları karıştırmayın, her iki çözelti arasında bir ara faz görülecektir).
- Tüpleri frensiz 950 g'da sıkın ve 4 °C'de 30 dakika boyunca yavaş hızlanma.
NOT: Bu adım, miyelini DPBS 1x ve% 22 yoğunluk gradyan ortamının interfazında tecrit ederek diğer hücrelerden ayırırken, hücreler tüpün dibinde pelet olacaktır. Miyelin giderimi, hücre konsantrasyonu çok yüksek olmadığında daha etkilidir.
- 10 mL'lik bir şırınga + iğne 23G x 1 '' kullanarak, interfazlarında sıkışan maksimum DPBS, yoğunluk gradyan ortamı ve miyelini atın.
- Hücreleri 0.5 mL Media A +% 2 normal keçi serumu (NGS) ile yıkayın, ardından tüpleri 300 g'da 4 ° C'de 10 dakika döndürün.
- Süpernatantın maksimumunu atın, ardından aynı deneysel koşuldaki tüm hücre peletlerini 1 mL Medya A +% 2 NGS'de bir araya getirin.
- İlgilenilen hücreler mpeg1:eGFP'den floresan protein benzeri bir makrofaj/mikroglia veya NBT:DsRed transgenik balıktan nöronlar eksprese ediyorsa, hücre süspansiyonunu 35 μm'lik bir hücre süzgeci kapağından geçirin ve bunları ışıktan korunan buz üzerinde soğuk 5 mL'lik bir FACS tüplerine aktarın.
NOT: Alternatif olarak, mikroglia'nın immün boyaması yapılabilir.