$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Mikroglia İmmün Boyama
NOT: Tüm adımlar 4 °C'de gerçekleştirilir.
- Beyin kültürü hücrelerinden elde edilen hücre peletini 0.3 mL Media A +% 2 normal keçi serumu veya NGS ile yeniden süspanse edin. Bunları 3 x 1.5 mL'lik tüplere bölün: biri ilgilenilen hücrelerden otomatik floresanı ölçmek için boyanmamış hücreler için, ikincisi ikincil antikorun mikrogliaya spesifik olmayan bağlanmasını ölçmek için ikincil antikor (1/200) için ve üçüncüsü bir test olarak (4C4 fare monoklonal antikoru (mikrogliaya özgü) (1/20) + ikincil antikor (1/200)).
- İmmünoglobulinlerin Fc alanı ile CD16 / CD32 etkileşimlerini bloke etmek için hücrelere (tüm tüpler) %1'de Düşük Endotoksin, Azid İçermeyen (LEAF) ekleyin. Her 5 dakikada bir hafif çalkalama ile hücreleri 10 dakika inkübe edin.
- 4C4 antikorunu (1/20) hücrelere (tüp 3) ekleyin ve her 10 dakikada bir hafif çalkalama ile 30 dakika inkübe edin.
- Tüpleri 300 g'da 4 °C'de 10 dakika döndürün, ardından süpernatanı atın.
- 0,5 mL Media A +% 2 NGS ile bir kez yıkayın, ardından tüpleri 300 x g'da 4 ° C'de 10 dakika döndürün.
- Hücre peletini 0.5 ml Media A +% 2 NGS ile yeniden süspanse edin ve hücreleri her 5 dakikada bir hafif çalkalama ile 10 dakika boyunca% 1'de LEAF ile inkübe edin.
- Hücrelere (tüp 2 ve 3) ikincil antikor (1/200) ekleyin. Her 10 dakikada bir hafif çalkalama ve ışık koruması ile hücreleri 30 dakika inkübe edin.
- Tüpleri 300 g'da 4 ° C'de 10 dakika döndürün, ardından süpernatanı atın.
- 0,5 mL Media A +% 2 NGS ile iki kez yıkayın, ardından 1 mL Media A +% 2 NGS ile hücre peletini yeniden süspanse edin.
- Hücre süspansiyonunu 35 μm'lik bir hücre süzgeci kapağından geçirin ve bunları ışıktan korunan buz üzerinde soğuk 5 mL floresanla aktive edilen hücre sınıflandırmasına veya FACS tüplerine aktarın.
2. Hücre Sıralama (FACS)
NOT: Tüm adımları 4 °C'de gerçekleştirin.
- Nöronları, makrofajları/mikrogliaları ve mikrogliaları bir FACS.
kullanarak sıralayın
NOT: Bu adım genellikle FACS tesisinin bir personeli tarafından gerçekleştirilir ve ayarlar kullanılan ekipmanın türüne bağlıdır.
- Ölü hücreleri etiketlemek için her FACS tüpüne 1 μg / mL konsantrasyonda DAPI ekleyin.
- FACS'ı kurun ve tüm beyin hücrelerinden nöronları, makrofajları/mikrogliaları veya mikrogliaları sıralayın. Hücreleri büyüklüklerine ve taneciklerine göre döküntülerden ayırın, ardından tek hücreleri ileri saçılma ve yan saçılma ile kapılayın. Canlı hücrelerden DAPI etiketlemesi ile ölü hücreleri hariç tutun. Nöronları, makrofajları/mikrogliaları veya mikrogliaları kendi pozitif boyamalarıyla tanımlayın.
- Buz üzerinde 1 mL buz gibi soğuk Medya A +% 2 NGS içeren 1.5 mL'lik tüplerde hücreleri toplayın. Her hücre tipi için farklı tüpler kullanın.
- Tüpleri 300 ° C'de 10 dakika boyunca 4 x g'da döndürün ve ardından süpernatanı atın.
- 0,5 mL Medya A ile bir kez yıkayın, ardından maksimum süpernatanı atın.