İn Vitro iHSPC'lerde Kısa Saç Tokası RNA Aracılı Gen Yıkımı: Spesifik Gen Ekspresyonunun Yıkılması için iHSPC'lere Lentivirus Tabanlı Bir shRNA Ekspresyon Sistemi Teslimatı

Özet

Kaynak: Hsiao, YL, et al. Hematopoietik Kök ve Progenitör Hücre Hattında Kısa Saç Tokası RNA Aracılı Gen Yıkımı ile Dendritik Hücre Gelişiminin İncelenmesi İn Vitro. J. Vis. Uzm. (2022).

Bu videoda, ölümsüzleştirilmiş hematopoietik kök ve progenitör hücrelerde (iHSPC'ler) stabil knockdown hücre hatları elde etmek için shRNA lentiviral vektörlerinin transdüksiyonunu gerçekleştirmek için bir yöntem gösteriyoruz.

Protokol

1. Ölümsüzleştirilmiş hematopoietik kök ve progenitör hücre hatlarının (iHSPC'ler) hazırlanması

1. iHSPC hücre hattını 100 ng / mL FL ve 1 μM β-estradiol içeren tam RPMI 1640 ortamında koruyun.
2. Hücreleri her 3 günde bir 1:10 oranında geçirin.
   not: % 10 fetal sığır serumu (FBS), 5 ^x10-5 M β-merkaptoetanol ve 10 μg / mL gentamisin ile takviye ederek tam RPMI 1640 ortamı yapın. Rekombinant murin FL de ticari olarak temin edilebilir.

2. Lentiviral transdüksiyon

1. 100 ng/mL FL, 1 μM β-estradiol ve 8 μg/mL polibren içeren 1 mL tam ortamda 12 oyuklu plakalarda 1 x 10⁵ hücre/kuyu yoğunluğunda plaka iHSPC'leri.
   not: Polibren konsantrasyonu hücre tiplerine bağlıdır ve genellikle 4-8 μg/mL aralığındadır.
2. Her oyuğa 100.
   'lik bir enfeksiyon çokluğunda (MOI) shRNA taşıyan lentivirüs ekleyin not: Lentiviral vektör, bir puromisin seçim markörü olan pLKO.1-Puro'dur (Şekil 1). Sırasıyla LacZ, Tcf4 ve Id2'ye karşı shRNA'ların hedef dizileri Malzeme Tablosunda listelenmiştir. MOI, enfeksiyon sırasında hücre başına eklenen virion sayısı ile tanımlanır.
   
3. Plakaları 37 ° C'de 90 dakika boyunca 1.100 x g'da döndürün.
4. Enfekte hücreleri içeren plakayı bir inkübatörde 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
   not: Hücreler polibrene duyarlıysa, spin enfeksiyonundan sonra hücreleri polibren içermeyen tam ortamla yenileyin.
5. Enfeksiyondan 24 saat sonra 100 ng / mL FL ve 1 μM β-estradiol içeren tam ortamlı hücreleri yenileyin.
6. Ek bir 24 h.
   sonra enfekte olmuş hücreleri seçmek için ortama 6 μg / mL puromisin ekleyin. not: Dönüştürülen lentiviral vektör, puromisine dirençli gen de dahil olmak üzere genleri eksprese etmek için genellikle 48 saat sürer. Puromisin konsantrasyonunun her hücre hattı için optimize edildiğinden emin olun.
7. Her 3 günde bir 100 ng / mL FL, 1 μM β-estradiol ve 6 μg / mL puromisin içeren seçim ortamını yenileyin ve stabil şekilde dönüştürülen iHSPC hücrelerini genişletmek için hücreleri en az bir hafta koruyun.
   not: Puromisin seçimi genellikle 48 saat sonra yürürlüğe girer ve seçim süresi hücre tiplerine bağlıdır.

Sonuçlar

Şekil 1: lentiviral vektör pLKO.1-Puro'nun yapısı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1,5 mL Mikro tüp	Ekstra Gen	TÜP-170-C
12 oyuklu doku kültürü ile muamele edilmiş plaka	doğan	353043
Fetal sığır serumu (FBS)	Corning	35-010-Özgeçmiş
RPMI 1640 orta	Gibco (Gibco)	11875-085
β-estradiol	Sigma-Aldrich	E2758-250MG
β-merkaptoetanol (β-ME)	Sigma-Aldrich	M6250
Flt3 ligandı (FL)	Ev yapımı
Polibren	Sigma-Aldrich	TR-1003-G
Puromisin	Canlılık	karınca-pr-1
shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390)	RNAi Konsorsiyumu (TRC)
shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224)	RNAi Konsorsiyumu (TRC)
shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094)	RNAi Konsorsiyumu (TRC)

Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi