Hepsi Bir Arada CRISPR Genom Düzenleme: CRISPR-Cas9 Sistemi Kullanılarak Kültürlenmiş Hücrelerde Homoloji Odaklı Onarım Tabanlı Gen Knock-In İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Zhang, L. et al, CRISPR/Cas9 ile Gen Knock-in ve Makrofaj ve T Hücre Hatlarında Hücre Sıralama. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu videoda, Cas9 ve sgRNA'nın hücrelere tek bir plazmit yapısı olarak sağlandığı kültürlenmiş hücrelerde hepsi bir arada CRISPR-Cas9 tabanlı genom düzenlemeyi gösteriyoruz. CRISPR-Cas9 sistemi ve eklenmesi istenen gen, başarılı gen düzenlemesini kolaylaştırmak için elektroporasyon tekniği ile hücrelere sokuldu.

Protokol

1. Makrofaj ve T Hücre Hatlarının Elektroporasyonu

1. Elektroporasyon için hücre kültürlerini hazırlayın
   1. Jurkat T hücreleri için tam büyüme ortamı olarak% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640'ı hazırlayın. RAW264.7 makrofajlarını kültürlemek için Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unu (DMEM) %10 FBS ile hazırlayın. Hücre sıralamasından önce transfeksiyon sonrası inkübasyon için kullanılan ortamlar hariç, tüm tam büyüme ortamlarını 100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin (Kalem / Strep) ile destekleyin.
   2. RAW264.7 ve Jurkat T hücrelerinin alt kültürlenmesini tedarikçinin talimatlarına göre gerçekleştirin (Bkz. Malzeme Tablosu). RAW264.7 hücrelerini alt kültüre alırken, hücreleri ayırmak için tripsin-EDTA çözeltisi (% 0.25) kullanın. RAW264.7 ve Jurkat hücreleri için bir kriyoprezervasyon ortamı olarak% 10 (h / h) DMSO ile desteklenmiş FBS kullanın.
   3. RAW264.7 makrofajları için 5 dakika boyunca 250 × g'da ve Jurkat T hücreleri için 8 dakika boyunca 90 × g'da hücreleri toplayın. Daha sonra 5-10 mL 1× DPBS (Ca²⁺ veya Mg²⁺ iyonları olmadan) ile yıkayın. DPBS'yi çıkarın.
   4. 2 mL 1× DPBS kullanarak hücre peletini yeniden süspanse edin. 10 μL hücre kullanın ve hücre sayısını ve canlılığını tahmin etmek için eşit hacimde %0.2 tripan mavisi ile karıştırın.
      not: Transfeksiyon gününde hücre kültürünün %>90 canlılığa sahip olduğundan emin olun.
   5. Tek bir knock-in deneyi için, beş tekrarlı 10 μL nükleofeksiyon uçları ile elektroporasyon gerçekleştirin. 2.0 × 106 hücre için gereken hacmi hesaplayın ve hücreleri santrifüjleme ile peletleyin. Hücre peletini adım 1.1.2.
      'de açıklandığı gibi 1× DPBS ile tekrar yıkayın. not: 10 μL nükleofeksiyon uçları kullanıldığında, elektroporasyon başına 4.0 × 10⁵ hücreye ihtiyaç vardır. Buna göre, bir knock-in deneyi için en az 2.0 × 10⁶ hücre hazırlayın.
   6. Kalem / Strep olmadan oyuk başına 0.5 mL tam büyüme ortamı (adım 1.1.1'de hazırlanan) içeren 24 oyuklu bir plaka hazırlayın ve 37 ° C'lik bir inkübatörde önceden ısıtın.

2. CRISPR/Cas9 bileşenlerinin elektroporasyonu ve hedefleme vektörü

1. Elektroporasyon sistemini açın. Aşağıdaki gibi optimize edilmiş elektroporasyon parametrelerini kullanın: RAW264.7 makrofajları için 1.400 V/20 ms/2 darbesi ve Jurkat T hücreleri için 1350 V/20 ms/2 darbesi.
2. Pipetlemeye bağlı numune kaybını hesaba katarak, her bir CRISPR/Cas9 vektöründen 2,5 μg içeren steril 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 55 μL'lik bir elektroporasyon karışımı hazırlayın (mRosa26 lokusu için pDsR-mR26-sg1 ve pDsR-mR26-sg2 ve hROSA26 lokusu için pDsR-hR26-sg1 ve pDsR-hR26-sg2), 2,4 μg doğrusallaştırılmış hedefleme vektörü (mRosa26 ve hROSA26 için pKR26-POI-iBFP veya pKhR26-POI-iBFPknock-in, EcoRI veya BamHI ile doğrusallaştırılmış) ve Yeniden Süspansiyon Tamponu R.
   not: Zamandan tasarruf etmek için, santrifüjleme sırasında elektroporasyon karışımı hazırlanabilir (adım 1.1.5).
3. Adım 1.2.2'den itibaren 55 μL'lik elektroporasyon karışımında 2.0 ×^{10 6} hücreyi (adım 1.1.5'te hazırlanmıştır) yeniden süspanse edin.
Bir
4. pipet ile 10 μL'lik bir nükleofeksiyon ucu kullanarak adım 1.2.3'ten hücre/elektroporasyon karışımını aspire edin.
   not: Pipetleme sırasında, elektroporasyon arızasına neden olabilecek hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının.
5. Numuneyi, elektroporasyon kitinden 3 mL Tampon E ile doldurulmuş bir tüpe ekleyin.
6. Adım 1.2.1'de açıklandığı gibi iki hücre tipi için elektroporasyon parametrelerini uygulayın.
7. Numuneyi, adım 1.1.6'dan itibaren önceden ısıtılmış ortam ile 24 oyuklu plakanın bir kuyucuğuna aktarın.
8. 1.2.4-1.2.7 adımlarını diğer dört tekrar için ve ayrıca yalnızca hedefleme vektörü ve yalnızca CRISPR ifade vektörü kontrolleri için tekrarlayın.
   not: Farklı bir hücre tipine/plazmit DNA'sına geçerken nükleofeksiyon ucunu ve tüpünü değiştirin.
9. Akış sitometrisi analizi veya floresanla aktive edilen hücre sınıflandırmasından (FACS) önce elektroporasyon ve CRISPR / Cas9 bileşenlerinin ekspresyonundan sonra geri kazanıma izin vermek için transfekte edilmiş hücreleri 48-72 saat boyunca kültürleyin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Ampisilin, sodyum tuzu	MP Biyomedikal	194526
Cellometer Mini Otomatik Hücre Sayacı	Nexcelom Biyobilim
DPBS (10X), kalsiyum yok, magnezyum yok	ThermoFisher Bilimsel	14200075
Dulbecco'nun yüksek glikozlu Modifiye Eagle Medium'u (DMEM)	HyClone (Klon	SH30022.01
Falcon 5 ml polistiren yuvarlak tabanlı test tüpü	BD Biyolojik Bilimler	352003
Fetal sığır serumu (FBS)	ThermoFisher Bilimsel	10099141
Jurkat	ATCC (Uzay Servisi)	TİB-152	https://www.atcc.org/
Kanamisin sülfat	MP Biyomedikal	194531
Çok Kanallı Pipet (30-300 μL)	Eppendorf veya benzeri
Neon Transfeksiyon Sistemi	ThermoFisher Bilimsel	MPK5000
Neon Transfeksiyon Sistemi, 10 μL kit	ThermoFisher Bilimsel	MPK1096
Nunc 15 mL Konik Steril Santrifüj Tüpleri	ThermoFisher Bilimsel	339651
Pipet ucu 0.1-20μl	Eppendorf veya benzeri	0030 075.005
Pipet ucu 2-200μl	Eppendorf veya benzeri	0030 075.021
Pipet ucu 50-1000μl	Eppendorf veya benzeri	0030 075.064
pX458-DsRed2	Ekle	112219
RAW264.7	ATCC (Uzay Servisi)	TİB-71	https://www.atcc.org/
RPMI 1640 Orta	HyClone (Klon	SH30027.01
Penisilin-Streptomisin	ThermoFisher Bilimsel	15140122
Tripan Mavisi Çözeltisi, %0,4	ThermoFisher Bilimsel	15250061
1,5 mL mikrotüpler, PCR temizliği	Eppendorf veya benzeri	0030 125.215
24 kuyulu Şeffaf TC ile muamele edilmiş Çoklu Kuyulu Plakalar	Corning	3524

) Serisi ) adet