Çinko Parmak Nükleaz Tabanlı Genom Düzenleme: İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde Çift Sarmallı Homoloji Bağımlı Onarım Mekanizması ile Genomu Değiştirme Tekniği

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Kök Hücreleri Düzenleme için Hazırlayın

1. Jelatin üzerinde büyütülmüş mitomisin C ile inaktive edilmiş fare embriyonik fibroblast (MEF) besleyicilerinin 2.4 × 10⁶ hücre / plakası içeren 6 oyuklu bir plaka üzerinde insan pluripotent kök hücrelerini (hPSC'ler) büyütün ve kültürleyin. hPSC'leri oyuk başına 3 ml insan embriyonik kök hücre ortamında (hESC ortamı) koruyun ve %3 O₂/5 CO₂.
   ile 37 ° C'lik bir inkübatörde büyütün not: Bu protokolün başarısı için, hPSC'lerin düşük oksijenli bir inkübatörde tutulması gerekli değildir; bununla birlikte, hPSC'lerin yüksek_O2 ortamında daha hızlı çoğaldığına dikkat etmek önemlidir, bu nedenle süreler ve hücre sayıları buna göre ayarlanmalıdır. Düşük oksijende tutulan hPSC'lerin daha düşük spontan farklılaşma oranlarına sahip olduğu da belirtilmelidir.
   1. 500 ml hESC ortamı yapmak için 380 ml DMEM/F12, 75 ml Fetal Sığır Serumu (FBS), 25 ml KnockOut Serum Replasmanı (KSR) birleştirin. Glutamin (1 mM nihai konsantrasyon), 5 ml 100x Esansiyel Olmayan Amino Asit, 100 birim / ml Penisilin-Streptomisin (P / S), bazik Fibroblast Büyüme Faktörü (bFGF) (4 ng / ml nihai konsantrasyon) ve 2-merkaptoetanol (5.5 μM nihai konsantrasyon).
2. Bir cam pipet ve vakum kullanarak ortamın tüm hacmini (3 ml) çıkararak ortamı değiştirin. Serolojik bir pipet kullanarak 3 ml ılık hESC ortamı ile değiştirin. hPSC'ler yaklaşık% 50 birleşene kadar (Gün-1) ortam değişikliğini her gün tekrarlayın.
3. Hedeflemeden bir gün önce (Gün-1), hESC ortamını değiştirin, eski ortamı çıkarın ve 10 μM Y-27632 ile desteklenmiş sıcak hESC ortamını ekleyin.
4. Ayrıca -1. Günde, DR4 farelerinden (2.4 × 10⁶ hücre / plaka) bir ila iki adet 6 oyuklu veya 10 cm'lik ilaca dirençli MEF besleyici hücre plakaları hazırlayın.
   Not: Genel olarak, 6 oyuklu plakalar, daha fazla ortam barındırdıkları için 10 cm'lik plakalara göre avantajlıdır. 6 kuyulu plakalar ayrıca farklı kuyulardan farklı klonların bağımsız olmasını sağlar. Bununla birlikte, 10 cm'lik bir plaka, bu işlem için mevcut mikroskoba bağlı olarak daha kolay toplamaya izin verecektir.

2. Pluripotent Kök Hücrelerin Düzenlenmesi

1. ZFN 1 ve 2'nin (Şekil 1) her birini 5 μg pipetleyerek 1,5 ml'lik bir tüpe transfeksiyon çözeltileri hazırlayın. 30 μg onarım plazmidini de bu tüpe pipetleyin. Son olarak, hacmi 300 μl.
   'ye çıkarmak için 1x Fosfat Tamponlu Salin (PBS) tüpe pipetleyin not: Transfeksiyon çözeltisinin toplam hacmini 300 μl'nin altında tutmak için plazmitleri minimum 300 ng/μl konsantrasyonda bir midiprep (herhangi bir kit uygundur) olarak hazırlayın. Fenol / kloroform ekstraksiyonu yapmak, plazmidi doğrusallaştırmak veya endotoksin içermeyen bir plazmit hazırlama kiti kullanmak gerekli değildir.
2. Bir cam pipet ve vakum kullanarak hPSC'lerden ortamı çıkarın. Hücreleri yıkamak için her bir kuyucuğa 2 ml ılık 1x PBS pipetleyin.
3. Bir cam pipet ve vakum kullanarak PBS'yi hemen çıkarın. 0.5 ml% 0.25 Tripsin-EDTA çözeltisini doğrudan her oyuktaki hücrelere ekleyin. İnkübatöre (37 °C/%5 CO_%2/3 O₂) yaklaşık 10 dakika veya besleyici tabaka plakadan kalkmaya başlayana kadar yerleştirin.
4. Tripsin reaksiyonunu durdurmak için her bir oyuğa 2 ml ılık esWash ortamı (470 ml DMEM / F12, 25 ml FBS, 100 birim / ml P / S) ekleyin.
5. Besleyici hücrelerin bir tabaka halinde çıktığından emin olun. Her bir oyuğun içeriğini, tüm oyukları birleştirerek 50 ml'lik tek bir konik tüpe pipetleyin. 10 ml'lik bir serolojik pipet kullanarak hücreleri tritüre edin. Besleyici tabakasını kırmak gerekli değildir; hPSC'ler hafif bir aşındırma ile besleyici katmanından çıkacaktır. Yaklaşık 15 ml hücre süspansiyonu olmalıdır.
6. Hacmi toplam 40 ml'ye çıkarmak için tüpe 25 ml esWash ortamı ekleyin. Büyük besleyici parçalarının 1-2 dakika tüpün dibine yerleşmesine izin verin. Serolojik bir pipet kullanarak süpernatanı (~ 38 ml) tüpten çıkarın ve 50 ml'lik yeni bir konik tüpe koyun.
7. 190 x g'da 5 dakika aşağı döndürün. Bir cam pipet ve vakum kullanarak süpernatanı tüpten çıkarın. Hücre peletini rahatsız etmediğinizden emin olun. Hücreleri 500 μl 1x PBS'de yeniden süspanse edin. Daha önce hazırlanan plazmid transfeksiyon çözeltisi ile birleştirin. Bu adımda hücreleri sayın. Elektroporasyon başına 5-10 milyon hücre kullanın.
8. 800 μl'lik süspansiyonun tamamını 4 mm'lik bir elektroporasyon küvetine pipetleyin, 3-5 dakika buzun üzerine koyun. Aşağıdaki parametrelerle elektroporasyon sistemindeki üstel programı kullanarak hücreleri elektriklendirin: 250 V, 500 μF, ∞ direnci ve 4 mm küvet boyutu. Elektroporasyondan sonra, küveti 3 dk.
   boyunca tekrar buzun üzerine yerleştirin not: Elektroporasyon sistemi üzerindeki elektroporasyonun zaman sabitini gözlemleyin. Zaman sabiti, hücre sayısı ve DNA saflığına göre değişir. Başarılı transfeksiyonlar, listelenen koşullar ve bir gen pulser II kullanıldığında genellikle 10-14 msn arasında bir zaman sabitine sahiptir. Zaman sabitleri bu değerlerden farklı olduğunda daha düşük elektroporasyon verimlilikleri ortaya çıkabilir.
9. Elektroporasyonlu hücreleri, 10 μM Y-27632 ile desteklenmiş 18 ml ılık hESC Ortamında yeniden süspanse edin. Bu tek hücreli süspansiyonun 3 ml'sini, DR4 besleyici hücreleri olan 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna yerleştirin. İnkübatöre geri dönün (37 °C/%5 CO_%2/3 O₂).

3. Pozitif Kolonilerin Seçimi

1. 2. Gün, bir cam pipet ve vakum kullanarak tüm ortamları çıkarın. 10 μM Y-27632 ile desteklenmiş 3 ml ılık hESC ortamı ile değiştirin. 3. Gün, bir cam pipet ve vakum kullanarak tüm ortamları çıkarın. Y-27632 dahil olmadan 3 ml ılık hESC ortamı ile değiştirin. 4. Gün, bir cam pipet ve vakum kullanarak tüm ortamları çıkarın. Seçim için antibiyotiklerle desteklenmiş 3 ml ılık hESC ortamı ile değiştirin. İnkübatöre geri dönün (37 °C/%5 CO_%2/3 O₂).
   not: Kullanılan antibiyotiğin türü, onarım şablonunda bulunan direnç kasetine bağlı olacaktır. WIBR # 3 hPSC'ler (NIH kayıt 0079) ile çalışırken, 0.5 μg / ml puromisin, 70 μg / ml G418 (genetik in) ve 35 μg / ml higromisin başarıyla kullanılmıştır. Seçim için konsantrasyonlar, yaklaşık bir hafta içinde vahşi tip hücreleri öldürmek için gereken minimum antibiyotik konsantrasyonu belirlenerek ampirik olarak belirlenmelidir.
2. 5-12. günlerde, besiyerini her gün değiştirin, her seferinde eski besiyerini antibiyotiklerle takviye edilmiş sıcak hESC besiyeri ile değiştirin.
   not: Büyük miktarda hücre ölümü bekleyin. Bireysel koloniler 8-10. gün civarında belirginleşecektir. Antibiyotiksiz normal hESC besiyeri, 12-14 günlük sürekli seçimden sonra kullanılabilir. Hücre yoğunluğu yüksekse veya hücre ölümü yavaşsa, ortamın asitleşmesinden kaçınılmalıdır ve seçimin ilk birkaç günü boyunca ortam hacmini (4-5 ml'ye kadar) artırmak gerekebilir.

Şekil 1. AAV-CAGGS-EGFP onarım şablonu kullanılarak düzenlenen gen düzenlemeli AAVS1 lokusunun şeması. Hockemeyer ve ark., 2009'dan değiştirilmiştir.