TALEN Aracılı Hedefli Gen Entegrasyonu: Floresan Protein Geninin hiPSC'lere Hassas Bir Şekilde Yerleştirilmesi için Tasarlanmış Diziye Özgü Nükleazların Kullanılması

Abstract

Kaynak: Cerbini, T. et al. İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Transfeksiyonu, Seçimi ve Koloni Toplaması Bir GFP Geni ile TALEN Hedefli AAVS1 Güvenli Limana. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu videoda, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerde veya hiPSC'lerde, hedeflenen bir lokusta çift sarmallı kırılmalar oluşturmak için TALEN'leri kullanarak floresan protein gen entegrasyonu için homolojiye yönelik onarımı indükleyen hassas bir genom düzenleme tekniği açıklanmaktadır.

Protocol

1. Temel Membran Matrisinin Hazırlanması ve Plastik Malzemelerin Kaplanması

1. -20 °C'den donmuş bazal membran matris stoğunu buzun üzerine yerleştirin ve gece boyunca 4 °C'de çözdürün.
2. Çözüldükten sonra, 2 mg bazal membran matrisini önceden soğutulmuş eppendorf tüplerine pipetleyin. İhtiyaç duyulana kadar -20 °C'de saklayın.
3. Bazal membran matris kaplı plakaları hazırlamak için, eppendorf tüpündeki son buz parçası kaybolana kadar (genellikle ~ 2 saat içinde) buz üzerinde bir alikotu çözdürün.
4. Çözüldükten sonra, bazal membran matris kaplama çözeltisi yapmak için 12 ml soğuk (4 °C) DMEM/F12'ye bazal membran matrisi ekleyin.
5. Uygun kültür kabına bazal membran matris çözeltisini ekleyin. 6 oyuklu bir plaka için, kuyu başına 1 ml dağıtın. Bazal membran matris çözeltisinin her bir kuyuyu tamamen kapladığından emin olmak için plakayı döndürün.
6. Parafilm, bazal membran matris kaplı plakayı/tabağı kapatın ve kullanmadan önce oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Alternatif olarak, bazal membran matris kaplı plakaları/tabakları 4 °C'de saklayın ve kaplamadan sonraki 2 hafta içinde kullanın.
   not: Kurumayı önlemek için bazal membran matris kaplı plakaya/tabağa ekstra DMEM/F12 ekleyin. 4 °C'de depolanmış bazal membran matris kaplı plaka/tabak kullanmadan önce biyolojik güvenlik kabinine koyun ve en az 30 dakika oda sıcaklığına gelmesini bekleyin.
7. Ortam ve hücrelerin eklenmesinden önce bazal membran matrisini tamamen aspire edin.

2. E8 ortamının hazırlanması

1. E8 takviyesini gece boyunca 4 ° C'de çözdürerek E8 kültür ortamını hazırlayın.
2. 500 ml'lik stoktan 10 ml E8 bazal besiyerini çıkarın ve atın.
3. 10 ml'lik E8 takviyesi şişesinin tamamını doğrudan 490 ml E8 bazal ortamına pipetleyin. Tekrarlanan sıcaklık dalgalanmaları tam E8 ortamındaki bFGF'yi bozabileceğinden, tam E8 ortamını 37 °C'lik bir su banyosunda ısıtmayın.
4. Ekin eklenmesinden sonraki 2 hafta içinde tam E8 ortamını kullanın.

3. iPSC'lerin çözülmesi

1. Bir şişe donmuş iPSC'yi sıvı nitrojenden çıkarın ve kuru buzun üzerine yerleştirin.
2. Şişeyi 37 ° C'lik bir su banyosunda hızla çözdürün; sadece küçük bir buz parçası kalana kadar şişeyi su banyosunda döndürün.
3. Şişeye% 70 etanol püskürtün ve biyolojik bir güvenlik kabinine aktarın.
4. 1 ml oda sıcaklığında E8 medium'u damla damla doğrudan şişeye ekleyin.
5. 2 ml'lik bir pipet kullanarak, hücre süspansiyonunu 15 ml'lik konik bir tüpte 9 ml E8 ortamına damla damla aktarın. Hücrelerin ve ortamın hızlı bir şekilde iyice karışmasını sağlamak için tüpü sık sık döndürün.
6. Hücreleri 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
7. Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini 10 μM Y-27632 ile desteklenmiş uygun bir E8 hacminde yeniden süspanse edin.
8. Hücreleri uygun sayıda bazal membran matris kaplı kuyucuklara ekleyin ve gece boyunca 37 °C, %5 CO₂ inkübatöre yerleştirin. Çözüldükten sonra hızlı toparlanmayı sağlamak için 6 oyuklu bir plakanın oyuğu başına en az 0,2 x 10⁶ iPSC plakalanması önerilir.

4. iPSC'lerin Bakımı ve Rutin Geçişi

1. E8 medium'u her gün yenileyin.
2. Ters çevrilmiş bir mikroskopla hücrelerin morfolojisini ve birleşmesini izleyin. Yüksek kaliteli iPSC'ler, farklı sınırlara sahip düz kolonilerde büyür; Bireysel koloniler "parke taşı benzeri" bir görünüme sahiptir.
3. iPSC hücrelerini ~% 70 birleşmeye ulaştıklarında geçirin.
4. 500 ml DPBS'ye 0,9 g NaCl ve 500 μl 0,5 M EDTA ekleyerek bir EDTA pasaj çözeltisi hazırlayın. NaCl'yi çözmek için iyice karıştırın ve sterilize etmek için filtreyi vakumlayın. Geçişten önce 37 ° C'lik bir su banyosunda geçen çözeltinin bir kısmını ısıtın.
5. Geçiş için, kullanılmış kültür ortamını aspire edin ve hücreleri eşit hacimde ılık geçiş çözeltisi ile bir kez yıkayın. Hücreleri kaplamak için yeterli EDTA geçiş solüsyonunu aspire edin ve pipetleyin (6 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 1 ml).
6. Hücreleri ters çevrilmiş bir mikroskop altına yerleştirin ve iPSC kolonilerini gözlemleyin. Kolonilerdeki deliklerin ve yükseltilmiş sınırların görünümü 2 ila 5 dakika içinde belirgin hale gelmelidir.
7. EDTA pasaj çözeltisini dikkatlice aspire edin.
8. 10 ml'lik bir pipet kullanarak, 4 ml E8 ortamını (6 oyuklu bir plaka kullanılıyorsa) yüksek basınç altında doğrudan geçilecek her bir oyuğa dağıtın.
9. iPSC kümelerini toplayın ve 1:8 ile 1:12 arasındaki bölme oranına bağlı olarak uygun sayıda kuyuya bölün. Hücre kümelerinin ayrışması canlılığın azalmasına neden olacağından aşırı pipetleme yapmayın.
10. Plakayı bir inkübatöre yerleştirin ve hücreleri dağıtmak için plakayı birkaç kez ileri geri ve yan yana sallayın.

5. Transfeksiyon için MEF'lerin ve iPSC'lerin Hazırlanması

1. Transfeksiyondan 48 saat önce, iPSC'leri ~ 1: 6'da bir bazal membran matrisi kaplı 6 oyuklu plakanın dört veya daha fazla kuyusuna geçirin, böylece iki gün sonra% 70 birleşim halinde olurlar.
2. Ertesi gün, DR4 MEF'leri %10 FBS ve 1x MEM-NEAA ile desteklenmiş DMEM (yüksek glikoz) içeren MEF ortamına çözün.
3. DR4 MEF'leri ~ 2 x 10⁴ hücre/cm²'de 10 cm'lik iki tabağa koyun ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
4. Transfeksiyon gününde, iPSC'lerde transfeksiyon yapmadan 30 dakika önce MEF ortamını 10 μM Y-27632 ile desteklenmiş E8 olarak değiştirin.
5. İsteğe bağlı: Transfeksiyondan 4 saat önce, transfeksiyon öncesi iPSC kültürünü 10 μM'lik son konsantrasyonda Y-27632 ile destekleyin.

>6. Bir Elektroporasyon Sistemi Kullanılarak iPSC'lerin Nazik Hücre Ayrışması Reaktif Tedavisi ve Transfeksiyonu

1. P3 birincil hücre transfeksiyon solüsyonunu 4 °C'den çıkarın ve ~ 30 dakika oda sıcaklığına gelmesine izin verin. Kullanmadan önce 100 μl takviyesinin tamamını transfeksiyon solüsyonuna ekleyin.
2. 37 °C su banyosunda ılık yumuşak hücre ayrışma reaktifi.
3. -20 °C'den AAVS1 TALEN'leri (pZT-AAVS1-L1 ve pZT-AAVS1-R1) ve AAVS1-CAG-EGFP donörü elde edin.
4. iPSC'leri inkübatörden çıkarın ve DPBS ile bir kez yıkayın.
5. Oyuk başına 1 ml yumuşak hücre ayrışma reaktifi ekleyin ve iPSC'leri 37 ° C'de 5 dakika boyunca veya hücrelerin% 50'sinden fazlası kültür kabından ayrılana kadar inkübe edin.
6. Kalan hücreleri kültür kabından ayırmak ve iPSC kümelerini parçalamak için bir p1000 pipeti kullanarak hücreleri birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
7. Her bir oyuğa 2 ml E8 ortamı ekleyin ve hücre kümelerini tek hücrelere daha fazla ayırmak için 10 ml'lik bir pipet kullanarak birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
   not: Hücre kümeleri yeterince ayrıştırılmazsa transfeksiyon verimliliği önemli ölçüde azalır.
8. iPSC'leri 15 ml'lik konik bir tüpte toplayın ve 3 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleyin.
9. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri minimum miktarda E8 ortamında yeniden süspanse edin.
10. % 0.4 Tripan mavisi gibi hayati bir lekenin uygulanmasından sonra bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Sayım sırasında hücrelerin yeterince ayrıştığından emin olun ("küme" başına 1-3 hücre).
11. İki adet 15 ml'lik konik tüpün her birine 3 x 10⁶ hücre dağıtın ve 3 dakika boyunca 100 x g'da tekrar döndürün.
    not: Düşük hızlı santrifüjleme, hücre stresini azaltır ve elektroporasyondan önce iPSC'lerin kolayca yeniden süspansiyon haline getirilmesini sağlar.
12. Elektroporasyon sistemini, insan embriyonik kök hücre hattı H9 (Program CB-150) için hücre tipine özel programa ayarlayın.
13. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı hücre peletlerinden aspire edin. Bir pelete, kontrol numunesi olarak 10 μg HR donörü ekleyin. Diğer pelete, deneysel numune olarak her bir TALEN'den (pZT-AAVS1-L1 ve pZT-AAVS1-R1) 5 μg ile birlikte 10 μg HR donörü ekleyin.
14. Her hücre peletini 100 μl P3 primer hücre transfeksiyon solüsyonunda yeniden süspanse edin ve bir küvete aktarın.
15. Transfeksiyonu gerçekleştirin ve hemen her küvete 500 μl oda sıcaklığında E8 ortamı ekleyin.
16. Kopyalanan iPSC'leri, adım 5.4'te hazırlanan DR4 MEF'leri içeren 10 cm'lik bir tabağa damla damla aktarın.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) Bazal Membran Matrisi, *LDEVS İçermez, 10 ml	Corning	354230	-20 °C'de saklayın.
DMEM/F-12	Yaşam Teknolojileri	11320-033	4 °C'de saklayın.
Costar 6 Kuyulu Şeffaf TC ile İşlem Görmüş Çoklu Kuyulu Plakalar	Corning	3506
Temel 8 Orta	Yaşam Teknolojileri	A1517001	Bazal ortamı 4 °C'de saklayın. Takviyeyi -20 °C'de saklayın.
Y-27632 dihidroklorür	Tocris (Türkçe)	1254	Oda sıcaklığında saklayın. H2O'da çözündükten sonra -20 ° C'de saklayın.
Sodyum Klorür	Sigma	S5886-500G
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0	Yaşam Teknolojileri	15575-020
DPBS, kalsiyum yok, magnezyum yok	Yaşam Teknolojileri	14190-250
100 mm TC ile İşlem Görmüş Kültür Kabı	Corning	430167
DR4 MEF 2M IRR - Akademik	Küresel Kök	GSC-6204G	Sıvı Azot içinde saklayın.
DMEM, yüksek glikoz, piruvat	Yaşam Teknolojileri	11995-040	4 °C'de saklayın.
Tanımlı Fetal Sığır Serumu, ABD Menşeili	HyClone (Klon	SH30070.03	-20 °C'de saklayın. Gece boyunca 4 °C'de çözdürün ve karıştırın. İhtiyaç duyulana kadar alikotları -20 °C'de saklayın.
MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100X)	Yaşam Teknolojileri	11140-050	4 °C'de saklayın.
4D-Nükleofektör Çekirdek ünitesi	Fransa	AAF-1001B	Elektroporasyon sisteminin bir parçası.
4D-Nükleofektör X birimi	Fransa	AAF-1001X	Elektroporasyon sisteminin bir parçası.
P3 Birincil Hücre 4D-Nükleofektör X Kiti L (24 RCT)	Fransa	V4XP-3024	Varışta, Birincil Hücre Çözeltisini çıkarın ve 4 ° C'de takviye edin ve saklayın.
StemPro Accutase Hücre Ayrışma Reaktifi	Yaşam Teknolojileri	A1110501	-20 °C'de saklayın. Gece boyunca 4 ° C'de çözdürün ve kullanmadan önce 37 ° C'lik bir su banyosunda bir alikotu ısıtın.
NutriStem XF/FF Kültür Ortamı	Kök	01-2005	-20 °C'de saklayın. Gece boyunca 4 °C'de çözdürün
AAVS1 TALEN'ler (pZT-AAVS1-L1 ve pZT-AAVS1-R1)	Ekle	52637 ve 52638
AAVS1-CAG-EGFP Homolog Rekombinasyon donörü	Ekle	22212
Puromisin Dihidroklorür	Yaşam Teknolojileri	A11138-03	-20 °C'de saklayın. ddH2O'da 1 mg / ml'lik çalışma alikotları hazırlayın.
Tek Kullanımlık Borosilikat Cam Pastör Pipetleri	Balıkçı Bilimsel	13-678-20A
Sorvall Legend XTR (Soğutmalı), 120 V 60 Hz	Termo Bilimsel	75-004-521
TX-750 4 × 750 ml Sallanan Kova Rotoru	Termo Bilimsel	75003607
Tripan Mavisi Çözeltisi, %0,4	Yaşam Teknolojileri	15250-061