$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Mikroenjeksiyon karışımı için plazmitlerin hazırlanması
NOT: Burada gösterilen protokol iki plazmitin kullanımını içerir: ilgilenilen transgeni taşıyan bir attB (konak bakteriden türetilen bağlanma bölgesi) etiketli donör plazmidi ve Drosophila Hsp70 promotörü regülasyonu altında φC31 integrazı eksprese eden bir yardımcı plazmit.
- Endotoksin içermeyen bir plazmit saflaştırma kiti kullanarak donör ve yardımcı plazmitleri saflaştırın.
not: Tüm bileşenlerin bütünlüğünü doğrulamak için enjeksiyon için kullanılan son plazmit preparatını sıralayın.
- Enjeksiyon tamponunda yeniden süspanse edildiğinde 350 ng / μL donör plazmid ve 150 ng / μL yardımcı plazmid nihai konsantrasyonu ile bir karışım elde etmek için iki plazmitin uygun miktarlarını birleştirin.
not: Gerekli karışım hacmini hesaplarken, planlanan enjeksiyonların her günü için 10-15 μL'nin yeterli olduğunu ve DNA'nın önceden hazırlanıp -20 °C'de saklanabileceğini göz önünde bulundurun. İntegraz yardımcı plazmid konsantrasyonları 60-500 ng/μL ve donör plazmid konsantrasyonları 85-200 ng/μL de bildirilmiştir.
- 0.1 hacim 3 M sodyum asetat (pH 5.2) ve 2.5 hacim buz gibi %100 EtOH ve girdap ekleyerek DNA'yı çökeltin. Beyaz bir çökelti hemen görünür olmalıdır. Yüksek konsantrasyonlu ilk plazmit preparatlarına (yani ~ 1 μg / μL) sahip olmak çökeltme verimliliğini artırır.
not: Durma noktası - Çökelti gece boyunca -20 °C'de saklanabilir.
- 4 ° C'de 20 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın ve peleti 1 mL buz gibi% 70 EtOH ile yıkayın.
- Peleti 1 mL buz gibi %70 EtOH ile yıkayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüjleyin.
- Peleti bozmadan süpernatanı atın ve havayla kurutun.
- Toplam 500 ng/μL.
nihai konsantrasyona ulaşmak için peleti 1x enjeksiyon tamponunda (0.1 mM Na3PO4, 5 mM KCl, pH 7.2, 0.22 μm filtre sterilize) yeniden süspanse edin
not: Çökeltme işlemi sırasında bazı DNA'ların kaybolacağını varsayalım; bu nedenle, önce daha küçük bir hacimde enjeksiyon tamponu ekleyin, bir spektrofotometrede (örneğin, Nanodrop) konsantrasyonu kontrol edin ve ardından 500 ng / μL'ye ulaşmak için uygun bir kalan hacim ekleyin.
- DNA'nın tamamen yeniden süspanse edildiğinden emin olun, her biri 10-15 μL'lik alikotlar hazırlayın ve bunları -20 ° C'de saklayın.
- Enjeksiyon gününde, bir alikotu çözün ve partikül kalıntılarını gidermek için 5 dakika boyunca 15.000 x g'da santrifüjleyin.
NOT: Partikül giderimi için alternatif bir yöntem, çözeltiyi 0,22 μm'lik bir filtreden filtrelemektir. Embriyo mikroenjeksiyonu sırasında iğne tıkanmasına yol açtığından, enjeksiyon karışımında partikül kalıntılarının varlığından kaçının.
2. Anopheles yerleştirme hattından embriyoların mikroenjeksiyonu
- Mikroenjeksiyondan 72 saat önce istenen yerleştirme hattından 4-7 günlük sivrisinekleri kanla besleyin (yani, Pazartesi ve Salı günleri enjeksiyon için dişileri bir önceki Cuma günü besleyin; Perşembe ve Cuma günleri enjeksiyon için aynı haftanın Pazartesi günü dişileri besleyin).
- Aynı gün vahşi tip (WT) sivrisinekleri (yani, yerleştirme hattının aynı genomik arka planına sahip sivrisinekleri) kanla besleyin; bunlar çaprazlama için gerekli olacaktır.
not: Kan ununun büyüklüğü ve kalitesi yumurta kalitesini etkiler, bu nedenle her zaman taze kan kullanılması önerilir (yani, son 7 gün içinde alınan kan). Kol besleme veya fareler üzerinde besleme, yumurtaların kalitesini ve miktarını artırabilir, ancak bu yöntemler teşvik edilmez. İnsan ve hayvan kullanımı için özel onaylanmış protokoller gerekli olacaktır.
- Embriyo mikroenjeksiyonları yapın
- Embriyonun arka kutbunu 45 derecelik bir açıyla hedefleyerek 25 mM NaCl'de An. gambiae embriyo mikroenjeksiyonları gerçekleştirin. Embriyo toplama, hizalama ve mikroenjeksiyon için ayrıntılı bir protokol için Pondeville ve ark.'ya bakınız.ve Lobo ve ark.
- Halokarbon yağı 700:27 (2:1) içinde embriyonun arka kutbunu 30 derecelik bir açıyla hedefleyerek An. stephensi embriyo mikroenjeksiyonları gerçekleştirin. Embriyo toplama, hizalama ve mikroenjeksiyon için ayrıntılı bir protokol Terenius ve ark.'da bulunabilir.ve Lobo ve ark.
- Enjeksiyondan hemen sonra yumurtaları steril damıtılmış su (pH 7.2) ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarın ve böcek koşullarına geri koyun.
- Yumurtadan çıktıktan sonra, G0 larvalarını her gün tuzlu damıtılmış su (% 0.1 tonik tuz) içeren bir tepsiye aktarın ve pupalara geri aktarın.
- Rekor kuluçka oranı (yani, yumurtadan çıkan larva sayısı / enjekte edilen embriyo sayısı).
not: Embriyo hareketi yumurtadan çıkmaya yardımcı olur, bu nedenle yumuşak dönme arzu edilir. Kuluçka, enjeksiyondan ~ 48 saat sonra başlamalıdır. Enjeksiyon hafif bir gelişimsel gecikmeye neden olabileceğinden, yumurtadan geç çıkan larvaların 3-4 gün boyunca izlenmesi tavsiye edilir.