$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Protospacer tanımı ve plazmid yapımı
NOT: Bu bölümde, sgRNA'yı oluşturmak ve pMaOri.dCas9'a daha fazla ligasyon yapmak için uygun ön-aralayıcıları seçmenin ilk adımı açıklanmaktadır (Şekil 1). Bu protospacer dizisi, istenen hedefe karşı 20 nükleotid dizisinden oluşur.
- GenBank'ta susturma için ilgilenilen genin nükleotid dizisini elde edin (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). "Fasta Hedefi"ni seçtikten sonra Streptococcus pyogenes Cas9 ve protospacer bitişik motif NGG için tanımlanan parametrelerle birlikte CHOPCHOP web sunucusuna (http://chopchop.cbu.uib.no/) gönderin. Parametreleri "CRISPR/Cas9" ve PAM (protospacer bitişik motif) NGG olarak tanımlayın.
- Elde edilen sonuçlara dayanarak, kodlama bölgesinin 5'ine mümkün olduğunca yakın bulunan ve en önemlisi, tam gen susturma için sgRNA'nın genin kodlama zinciriyle eşleşmesi gerektiğinden, şablon (eksi) zincirde yer alan, mümkün olan en iyi puana (yeşil ok) sahip protospacer'ları seçin.
not: NGG motifi, son sgRNA dizisine dahil değildir.
- 32' ucunda değişken bir 20 nükleotid dizisi ve korunmuş bir dCas5 iskele dizisi içeren tek kılavuz RNA'yı ifade etmek için lipL9 promotörü kullanın. Protospacer olarak adlandırılan 20-nt dizisini lipL32 promotörü (5' ucunda) ve sgRNA iskelesi (3'end) ile birleştirin (Şekil 1B).
not: İyi tanımlanmış bir lipL32 promotörü için, TSS'ye -334'ü içeren promotör bölgesini kullanın (Zhukova ve ark.'ya dayalı Transkripsiyon Başlangıç Sitesi). Son sgRNA kaseti için Tablo 1'i kontrol edin.
- Sıralı PCR ile sgRNA kasetini oluşturun veya ticari bir sağlayıcı tarafından sentezlenmesini sağlayın.
- Kaseti aldıktan sonra, her iki uçta (cccggg) XmaI kısıtlama bölgesinde pMaOri.dCas9 plazmidine bağlayın.
- Hem sgRNA kasetini hem de pMaOri.dCas9 plazmidini XmaI kısıtlama enzimi ile sindirin ve ligasyona devam edin (Şekil 1B).
- dT oksotrofik E. coli suşu π1'de klonlama adımlarını gerçekleştirin, pMaOri (ve buna bağlı olarak, pMaOri.dCas9) replikasyon orijini, R6K-gamma.
NOT: Ligasyon ve klon seçimi için ayrıntılı bir protokol için Fernandes ve Nascimento'nun önceki yayınlarına bakın. sgRNA kılavuzluğunda dCas9, seçilen ilgilenilen genin kodlama zincirine bağlanacak ve bu nedenle RNA polimeraz uzamasını engelleyecek (Şekil 1C), bu da gen susturulmasına neden olacaktır.
>2. Konjugasyon ile Leptospira dönüşümü
>NOT: Bu adımın grafiksel şeması Şekil 2'de sunulmuştur. HAN medyası ve HAN plakaları yapmak için Hornsby ve ark. ve Fernandes ve ark.
- Patojenik Leptospira hücrelerini, taze HAN'da doymuş bir kültürü 1:100'de seyrelterek ajitasyon altında HAN ortamında 29 veya 37 ° C'de büyütün; tipik olarak, L. interrogans serovar Kopenhagen suşu Fiocruz L1-130'un uygun hücre yoğunluğuna ulaşması 4-6 gün sürer.
- Konjugasyon için kullanmadan önce kültürlerin 420 nm'de (2 ila 5 x 108 hücre / mL) 0.2-0.4 OD'ye ulaştığından emin olun.
not: Hücre yoğunlukları arttıkça HAN ortamı renk değiştirdiğinden (DMEM ortamında bulunan fenol kırmızısı nedeniyle), leptospirleri çıkarmak için 1 mL kültür ortamını santrifüjleyin (4.000 x g, 15 dakika, oda sıcaklığı) ve OKD'yi ölçmek için bir boşluk olarak süpernatan uygulayın.
- Diaminopimelik asit (DAP) için oksotrofik olan konjugatif E. coli suşu β2163'ü, sgRNA kasetini içeren plazmid pMaOri.dCas9 ile dönüştürün. E. coli dönüşümü için, ısı-şok protokolleri veya elektroporasyon kullanın. Kontrol olarak sgRNA kaseti olmayan plazmid pMaOri.dCas9 ile dönüşümü dahil edin.
- Isı şoku dönüşümü için, plazmit DNA'sını (100 ng) kimyasal olarak yetkin E. coli hücreleri ile karıştırın ve 30 dakika buz üzerinde inkübe edin. 90 saniye boyunca 42 ° C'de ısı şoku uygulayın ve 5 dakika boyunca tekrar buzun üzerine koyun. 1 mL LB ortamı ekleyerek hücreleri geri kazanın, 37 ° C'de 1 saat inkübe edin ve kaplamaya devam edin.
- Elektroporasyon için, 100 ng plazmit DNA ile karıştırılmış elektroyetkin hücreler kullanın. Darbe için aşağıdaki parametreleri kullanın: 1,8 kV, 100 Ω ve 25 μF. Hücreleri yukarıda açıklandığı gibi kurtarın.
- Plazmitleri seçmek için dönüştürülmüş donör E. coli hücrelerini, Diaminopimelik asit (DAP) (0.3 mM) ve spektinomisin (40 μg / mL) ile takviye edilmiş LB agar ortamında plakalayın.
- Konjugasyon için, konjugasyon gününden bir gün önce her plakadan bir koloni seçin (bu, leptospires kültürlerinin OD'si izlenerek belirlenir).
- Boş pMaOri.dCas9'dan bir E. coli β2163 kolonisi ve pMaOri.dCas9sgRNA plakalarından bir koloni seçin. 37 ° C'de 10 mL LB artı DAP ve spektinomisin ile gece boyunca büyümelerine izin verin.
- Ertesi gün, doymuş kültürleri 10 mL taze LB artı DAP'ta 1:100 oranında seyreltin (buraya antibiyotiği dahil etmeyin) OD420nm 0.2-0.4'e kadar. Normalde, E. coli'nin bu yoğunluklara ulaşması 2-3 saat sürer.
- Bir BSL2 biyogüvenlik davlumbazının içinde, cam tabanın üstüne 25 mm çapında, 0.1 μm gözenek boyutunda, karışık selüloz ester membran filtresi yerleştirerek bir filtrasyon aparatı monte edin. Üstüne 15 mL'lik bir cam huni yerleştirin ve her iki parçayı da yaylı kelepçelerle tutun. Camı bir vakum pompasına bağlayın ve kültürleri filtrasyon için huniye ekleyin.
- Huniye 5 mL Leptospira kültürü ekleyin. Her iki kültürün OD420nm değerlerine dayalı olarak 1: 1 oranını oluşturmak için bir hacim E. coli ekleyin. Vakum pompasını açın ve hücreleri süzülerek konsantre edin. Membran filtredeki hücre konsantrasyonundan sonra, dikkatlice geri alın. Ortamın membrandan süzüldüğünden emin olun.
not: Filtrasyon 5 ila 10 dakika sürer.
- Filtreyi, DAP (0.3 mM) ile desteklenmiş, piyasada bulunan bir EMJH plakasına (Malzeme Tablosuna bakın) yerleştirin. Bakteri tarafının yukarıda olduğundan emin olun. Plakaları 29 °C'de 24 h.
inkübe edin
not: HAN veya takviye edilmiş kurum içi EMJH plakaları kullanılırsa, E. coli çoğalabilir ve amaçlanan 1: 1 oranının üstesinden gelebilir, bu da konjugasyon verimliliğini azaltabilir.
- 24 saat sonra, filtreleri plakalardan kurtarın ve her bir filtreyi 50 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin.
- Kapsamlı pipetleme ve girdaplama ile hücreleri filtre yüzeyinden serbest bırakmak için 1 mL sıvı HAN ortamı kullanın.
- Hücre canlılığını ve hareketliliğini kontrol etmek için geri kazanılan karışık bakteri çözeltilerini karanlık alan mikroskobu ile görselleştirin ve Leptospira: E. coli oranları.
not: Bu aşamada E. coli ve Leptospira'nın eşdeğer sayıları görülebilir.
- Bu kültürün 100-200 μL'sini% 0.4 inaktive tavşan serumu ve% 40 μg / mL spektinomisin içeren HAN plakalarına yayın. Plakaları 37 °C'de %3 CO2 atmosferinde inkübe edin.
güçlü >NOT: Normalde, L. interrogans serovar Kopenhageni suşu Fiocruz L1-130 hücreleri, kontrol plakalarında 5-7 gün içinde ve spektinomisin plakalarında 8-10 gün içinde koloniler oluşturur. Bu aşamada, E. coli, DAP için oksotrofik oldukları için büyümeyecektir.
- Kontrol olarak, kültürleri 104 leptospir / mL'de seyreltin ve leptospiral büyümeyi izlemek için antibiyotiksiz plakalara 100 μL ekleyin.