siRNA Ters Transfeksiyon Tabanlı Gen Susturma In Vitro: Hedef Gen Ekspresyonunu İnaktive Etmek için Kültürlenmiş Hücrelerde Küçük Enterferans Yapan RNA Verme Prosedürü

Özet

Kaynak: Jager, J. et al.Protein ve Mikro-RNA Modülasyonunun Adiposit Fonksiyonu Üzerindeki Etkisini İncelemek İçin Bir Adiposit Hücre Kültürü Modeli. J. Vis. Exp. (2021).

Bu videoda, bir hedef proteinin ekspresyonunu modüle etmek için siRNA'nın adipositlere ters transfeksiyonunu gerçekleştirmek için bir prosedürü açıklıyoruz.

Protokol

1. Ön kaplamalı plakaların hazırlanması

1. Transfeksiyondan bir gün önce veya transfeksiyondan birkaç saat önce, 1 mg / mL'lik bir stok çözeltisinden% 30 etanol içinde 100 μg / mL'de bir kollajen tip I çözeltisi hazırlayın. 12 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 250 μL ve 24 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 125 μL ekleyin ve çözeltiyi kuyu yüzeyine yayın.
2. Kollajen kuruyana kadar plakayı kültür başlığının altında kapaksız bırakın. Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (D-PBS) ile iki kez yıkayın.
   NOT: Önceden kaplanmış plakalar satın alınabilir.

2. Transfeksiyon karışımının hazırlanması

NOT: siRNA'nın nihai konsantrasyonu 1 ila 100 nM arasındadır (12 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 1 ila 100 pmol siRNA). MiR taklidinin son konsantrasyonu 10 nM'dir (10 pmol / kuyu). Hedef dışı etkilerden kaçınmak için deneye başlamadan önce her bir siRNA, miR taklidi veya diğer oligonükleotidin en iyi konsantrasyonunu belirleyin. Sonuçların istatistiksel analizini kolaylaştırmak için transfeksiyon deneylerini üç kopya halinde gerçekleştirin. Pipetleme sırasında normal kaybı hesaba katmak için tüm reaktifleri fazla hazırlayın.

1. siRNA'yı (veya diğer oligonükleotidleri) geliştirilmiş Minimal Esansiyel Ortam ile pipetleyerek (hacim/hacim) karıştırın (Tablo 1). Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
2. Transfeksiyon reaktifini ve geliştirilmiş Minimal Esansiyel Ortamı siRNA'ya ekleyin ve karıştırmak için pipetleyin (Tablo 1). Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin (bu süre zarfında bölüm 3'e geçin). Transfeksiyon karışımını kollajen kaplı plakanın her bir oyuğuna ekleyin.

3. 3T3-L1 adipositlerinin hazırlanması

1. 100 mm'lik Petri kabındaki hücreleri D-PBS ile iki kez yıkayın. Hücrelere 5x tripsin ekleyin (100 mm'lik tabak başına 1 mL), tüm yüzeyi tripsin ile kapladığınızdan emin olun. 30 saniye bekleyin ve tripsini dikkatlice çıkarın.
2. Petri kabını inkübatörde 37 °C'de 5-10 dakika inkübe edin. Hücreleri ayırmak için 100 mm'lik çanağa hafifçe vurun.
3. Tripsini nötralize etmek için piruvat, 25 mM glikoz,% 10 FCS ve% 1 penisilin ve streptomisin içermeyen 10 ml DMEM ekleyin. Hücreleri ayırmak ve hücre süspansiyonunu homojenize etmek için ortamı dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyin.
4. Bir Malassez sayma odası veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın ve hücrelerin konsantrasyonunu 6.25 x 10⁵ hücre / mL ortama ayarlayın. 12 oyuklu bir plakanın (5 x 10⁵ hücreli) 800 μL'lik hücre süspansiyonunun/kuyucuğunun veya transfeksiyon karışımını içeren 24 oyuklu bir plakanın (2.5 x 10^{5 hücreli}) hücre süspansiyonunun/kuyucuğunun 400 μl'sini tohumlayın.
   not: Bir adet 100 mm'lik Petri adiposit kabı, bir adet 12 oyuklu plakanın veya bir adet 24 oyuklu plakanın hazırlanmasına izin verecektir. 100 mm'lik bir tabak genellikle 6-7 x 10⁶ adiposit içerir, bu da 12 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 5 x 10⁵ adipositlere karşılık gelir.
5. Plakaları bir hücre kültürü inkübatöründe (% 7 CO2 ve 37 ° C) inkübe edin ve hücreleri 24 saat boyunca rahatsız etmeyin. Ertesi gün, süpernatanı piruvat, 25 mM glikoz,% 10 FCS ve% 1 penisilin ve streptomisin içermeyen taze DMEM ile dikkatlice değiştirin.
   NOT: Hücreleri kollajen önceden kaplanmış 48 ve 96 oyuklu plakalara tohumlamak da mümkündür, ancak adipositlerin ayrılmasını önlemek için ortamı değiştirirken daha fazla önlem alın.

	Kuyu başına (12 oyuklu plaka)	Kuyu başına (24 oyuklu plaka)
Oligonükleotidler	20 μL	10 μL
(si-RNA, miR...)
Geliştirilmiş Minimal Esansiyel Orta	20 μL	10 μL
Transfeksiyon reaktifi	5,6 μL	2,8 μL
Geliştirilmiş Minimal Esansiyel Orta	154,4 μL	77,2 μL
Transfeksiyon karışımının toplam hacmi	200 μL	100 μL

Tablo 1: 12 oyuklu ve 24 oyuklu plaka formatları için gerekli transfeksiyon reaktifleri.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
12 kuyulu Doku Kültürü Plakası	Dutscher	353043
% 2.5 Tripsin (10x)	Gibco (Gibco)	15090-046	D-PBS ile 5 kata kadar seyreltilmiş
2-Propanol	Sigma	I9516 Serisi
3-İzobutil-1-metilksantin	Sigma-Aldrich	D5879
Sığır Serum Albümini (BSA)	Sigma	A7030
Baldır derisinden elde edilen kollajen tip I	Sigma-Aldrich	C8919
Deksametazon	Sigma-Aldrich	D1756
D-PBS (İngilizce)	Gibco (Gibco)	14190144
Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Kartal Ortamı (DMEM)	Gibco (Gibco)	41965062	4,5 g/L D-Glikoz; L-Glutamin; Piruvat yok
etanol	Sigma	51976
miRIDIAN mikro-RNA taklitleri	Ufuk Keşfi
FAM etiketli negatif kontrol siRNA	Canlandırıcı	AM4620
Yenidoğan Buzağı Serumu	Gibco (Gibco)	16010-159
Fetal Sığır Serumu	Gibco (Gibco)	10270-106
Penisilin ve Streptomisin	Gibco (Gibco)	15140-122
FAM etiketli negatif kontrol siRNA	Canlandırıcı	AM4620
ON-TARGETplus Fare Plin1 siRNA SMARTpool	Ufuk Keşfi	L-056623-01-0005
Serbest Gliserol Reaktifi	Sigma-Aldrich	F6428 Serisi
Petri kabı 100 mm x 20 mm	Dutscher	353003
Transfeksiyon reaktifi (INTERFERin)	Çoklu artı	409-10
Geliştirilmiş Minimal Esansiyel Orta (Opti-MEM)	Gibco (Gibco)	31985-047
İnsülin, İnsan Rekombinantı	Gibco (Gibco)	12585-014

Gazetesi Serisi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Serisi Serisi Gazetesi