$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. İlgilenilen geni (GOI) ifade eden yanıt plazmitinin primer alveolar epitel hücrelerine transfeksiyonu
- Tip II alveolar epitel hücrelerini sıçan akciğerlerinden izole edin.
- Hücreleri 1 x 106 hücre/cm2 yoğunlukta, 100 mm'lik Petri kaplarında tam minimum esansiyel ortam (tam MEM) ile tohumlayın. Tam MEM, %10 FBS, 0.08 mg/L tobramisin, Septra (3 μg/mL trimetoprim ve 17 μg/mL sülfametoksazol), %0.2 NaHCO3, 0.01 M HEPES (pH = 7.3) ve 2 mM L-glutamin ile desteklenmiştir. Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde% 5 CO2 içinde 37 ° C'de 24 saat boyunca kültürleyin.
- Ertesi gün, yeni bir 12 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 500 μL antibiyotiksiz tam MEM yerleştirin ve plakayı 37 °C'de 30 dakika önceden ısıtın. Bu adım sırasında, kontamine tetrasiklinler içermeyen veya indüklenebilirliğe müdahale edemeyecek kadar düşük bir seviyede fetal sığır serumu kullanmak önemlidir.
- RT'de kuyucuk başına 1 μg GOI plazmid ve 1 μg düzenleyici vektör ekleyerek indüklenebilir GOI (GOI plazmid) ve düzenleyici vektör (örn., pTet-Off) ile plazmidi içeren 1.5 mL tüpleri hazırlayın. RNA bağlayıcı proteinler (RBP) ile birlikte ekspresyon deneyleri için, ilgilenilen RPB'yi ifade eden 1 μg kurucu vektör (örneğin, pcDNA3) DNA karışımına eklenir (Şekil 4).
- Ortamı aspire edin ve hücreleri 37 ° C'de önceden ısıtılmış PBS (kalsiyum ve magnezyum olmadan) ile nazikçe durulayın.
- 37 ° C'de önceden ısıtılmış 5 mL %0.05 tripsin ekleyin ve hücreler ayrılana kadar (2-4 dakika) hücreleri inkübe edin. Antibiyotik olmadan 10 mL tam MEM ekleyerek tripsini nötralize edin.
- Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik bir tüpte toplayın, mümkün olduğunca çok sayıda hücre toplamak için Petri kabını 4 mL ortamla yıkayın ve ardından hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı nazikçe aspire edin ve atın ve peleti 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin. Bir hemositometre kullanarak hücre sayısını sayın ve hesaplayın.
- Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı nazikçe aspire edin ve peleti 4 x 107 hücre / mL konsantrasyonda yeniden süspansiyon tamponunda yeniden süspanse edin. Hücreleri, 2.4. adımda oyuk başına 400.000 hücre konsantrasyonunda hazırlanan 1.5 mL'lik tüpten ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek hafifçe karıştırın.
- Tüpü elektroporasyon cihazına yerleştirin ve 3.5 mL elektrolitik tampon ile doldurun.
- Pistona tamamen bastırarak altın kaplama bir elektrot ucunu bir pipete yerleştirin. 1,5 mL'lik tüpün içeriğini nazikçe karıştırın ve hücreleri pipetle dikkatlice aspire edin. Hava kabarcıklarının uca girmesini önlemek için dikkatli olun, çünkü bu, elektroporasyon sırasında elektrik arkına neden olur ve transfeksiyon verimliliğinin azalmasına neden olur.
- Pipeti bir tık sesi gelene kadar elektroporasyon istasyonuna sokun.
- Alveolar epitel hücreleri için 1.450 V'luk bir darbe voltajına ve 2 ms genişliğinde 20 darbeye karşılık gelen uygun elektroporasyon protokolünü seçin ve dokunmatik ekranda Başlat'a basın.
- Transfeksiyondan hemen sonra, pipeti çıkarın ve hücreleri daha önce 37 ° C'ye ısıtılmış antibiyotik içermeyen tam MEM ile doldurulmuş bir kuyuya aktarın.
- Kalan numuneler için 1.11-1.14 adımlarını tekrarlayın.
- Hücreleri kuyu yüzeyine eşit şekilde yaymak için plakayı hafifçe sallayın. Hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde% 5 CO2 içinde 37 ° C'de inkübe edin. 2 gün sonra, ortamı antibiyotiklerle tam MEM ile değiştirin.
- Bir floresan mikroskobu altında eGFP ekspresyonunu gözlemleyerek veya bir kontrol vektörü kullanarak akış sitometrisi ile transfeksiyonun başarısını doğrulayın (Şekil 1).
not: Bu adım isteğe bağlıdır ve pcDNA3-EGFP gibi eGFP'yi ifade eden farklı bir plazmit kullanılarak ek bir transfeksiyon adımı gerektirir.
2. GOI'nin transkripsiyon inhibisyonunun indüksiyonu
>NOT: Hücreler, mRNA stabilitesi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için doksisiklin indüksiyonundan önce istenen tedavilerle ön işleme tabi tutulabilir (Şekil 3).
- Deiyonize suda 1 mg / mL'lik bir doksisiklin stok çözeltisi hazırlayın. Stok çözeltisini -20 °C'de ışıktan koruyarak saklayın. Bir tetrasiklin türevi olan doksisiklin, tetrasiklinden daha uzun bir yarı ömre (2x) sahip olduğu için tetrasiklin yerine kullanılır. Ayrıca, tet operonunun tamamen inaktivasyonu için daha düşük bir doksisiklin konsantrasyonu gereklidir.
not: Doksisiklin, endojen GOI'nin mRNA ekspresyonunu etkileyebilir. Bunu doğrulamak için, doksisiklin ile 24 saatlik bir tedavinin alveolar hücreler üzerindeki etkisi, GOI ekspresyonunda herhangi bir değişiklik olmadığını doğrulamak için test edilmelidir (Şekil 2).
- Transfeksiyondan 72 saat sonra tam MEM'de taze 1 μg / mL doksisiklin çözeltisi hazırlayın ve 37 ° C'ye ısıtın.
- GOI'nin transkripsiyonunu inhibe etmek için ortamı, oyuk başına 1 μg / mL doksisiklin içeren 1 mL tam MEM ile değiştirin.
- GOI'nin mRNA yarı ömrünü değerlendirmek için 15 dk-6 saat arasında farklı süreler boyunca% 5 CO2 içinde 37 ° C'de birden fazla kuyuyu inkübe edin.
- İşlemin sonunda, hücreleri buz gibi soğuk PBS ile yıkayın ve kuyucuk başına 500 μL tampon ekleyerek ve hücreleri homojenize etmek için plakayı sallayarak ticari olarak temin edilebilen bir fenol-kloroform RNA ekstraksiyon kiti ile parçalayın.
- RNA'yı üreticinin protokolüne göre izole edin. 230, 260 ve 280 nm'de spektrofotometri ile RNA verimini ve saflığını belirleyin. Sırasıyla 260:230 ve 260:280 oranlarında 1.8 ve 2.0 olan RNA örnekleri saf olarak kabul edilir.
not: Protokol buradan duraklatılabilir.
