Arabidopsis Bitkilerinde İkili Bakteriyel Yapay Kromozom Vektör Tabanlı Gen Dönüşümü: Tek Kopya Yerleştirme ile Transgenik Bitkiler Oluşturma Tekniği

1. Arabidopsis (Arabidopsis) Dönüşüm

1. Arabidopsis bitkilerini dönüşüm için hazırlayın.
   1. Arabidopsis bitkilerini çiçek açana kadar bir serada veya iklim kontrollü büyüme odasında büyütün (daldırma başına her biri 9 bitki içeren 12 saksı).
   2. Daha fazla ikincil cıvatanın ortaya çıkmasına izin vermek için ilk cıvataları klipsleyin. Bitkiler, kırpıldıktan 4-6 gün sonra, bitkilerin çok sayıda olgunlaşmamış çiçek başına sahip olduğu ve çok fazla döllenmiş silisiğe sahip olmadığı zaman daldırmaya hazırdır.
2. Çiçek daldırma
   1. Çiçek salkımlarını, ikili bakteriyel yapay kromozom veya BIBAC ile klonlanmış T-DNA taşıyan Agrobacterium süspansiyonuna 5-10 saniye daldırın. Hafif çalkalama kullanın.
   2. Nem oranını yüksek tutmak için bitkilerin toprak üstü kısımlarını streç filme sarın ve bitkileri karanlıkta tutmak için bitki saksılarını bir kutu ile örtün. Bitkileri bir serada / büyüme odasında 2 gün kuluçkaya yatırın.
   3. Kutuyu ve streç filmi çıkarın ve bitkileri bir serada/büyüme odasında olgunlaşana kadar büyütün.
      not: Dönüşümün verimliliğini artırmak için, aynı bitkiler ilk daldırmadan 7 gün sonra tekrar daldırılabilir.
   4. Tohumları hasat edin. Aynı yapıyla dönüştürülen bitkilerin tohumlarını (T1) tek bir set olarak bir araya getirin ve analiz edin.
3. Transgenik bitkiler için ekran.
   1. Bir pBIBAC-RFP-GW türevi ile dönüştürülen transgenik bitkileri taramak için tohumları floresan mikroskobu kullanarak analiz edin. Tohum kabuklarında DsRed ekspresyonunu tespit etmek için, tohumları 560 nm'lik bir uyarılmada ve 600-650 nm'lik bir emisyonda görüntüleyin. Floresan tohumları forseps kullanarak floresan olmayan muadillerinden ayırın.
   2. Bir pBIBAC-BAR-GW türevi ile dönüştürülmüş transgenik bitkileri taramak için tohumları toprakla dolu tepsilere ekin (~ 2.500 tohum / 0.1 m²). Tohumların tepsilere eşit şekilde yayılmasını sağlamak için, tohumları 0,5x Murashige Skoog ortamında (MS) %0,1 agarda askıya alın ve tohumları 1 mL pipet kullanarak yayın.
      not: Tohumları senkronize bir şekilde çimlenmeye teşvik etmek için tohumları 4 °C'de en az 2 gün kuluçkaya yatırın. Bu, tohumların ekilmesinden önce veya sonra yapılabilir.
      1. Fidelere tepsilere ekimden 2 hafta ve 3 hafta sonra% 0,5 Glufosinat-amonyum çözeltisi püskürtün. 1^m2 başına 500 mL Glufosinat-amonyum çözeltisi kullanın.
      2. Hayatta kalan fideleri ayrı saksılara aktarın. (İkinci) Glufosinat-amonyum işleminden önce ve sonra fidelerin bulunduğu bir tepsinin tipik bir görüntüsü Şekil 1'de gösterilmektedir.
      3. Glufosinat-amonyuma dirençli bitkileri, ilgilenilen yapının varlığı için PCR ile analiz edin.
         1. PCR için genomik bitki DNA'sını izole edin.

Şekil 1: Glufosinat-amonyum işleminden önce ve sonra Arabidopsis fideleri ile doldurulmuş tepsi. pBIBAC-BAR-GW T-DNA'da bulunan bar genini ifade etmeyen fideler, Glufosinat-amonyum çözeltisi püskürtüldükten sonra ölür. Fotoğraflar, (A) Glufosinat-amonyum ile püskürtülmeden önce, ekimden 14 gün sonra ve (B) 10 gün sonra, iki kez püskürtüldükten sonra aynı fide tepsisini göstermektedir.