$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Morpholino oligo tasarımı
>NOT: A. mexicanus için diziler, Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi (NCBI) Geni ve NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) aracılığıyla ve ayrıca Ensembl genom tarayıcısından (https://www.ensembl.org) edinilebilir. Hem yüzeyde hem de mağarada yaşayan formlarda kullanılmak üzere bir morfolino tasarlarken, bu aşamada morflar arasındaki herhangi bir genetik varyasyonu tanımlamak çok önemlidir, bu nedenle bu genetik bölgelerin morfolinolar için hedef olarak önlenmesi mümkündür. Bir morfolino hedef bölgesindeki herhangi bir polimorfik varyasyon, etkisiz bağlanmaya yol açabilir. Tasarım, zebra balığı gibi diğer balık sistemlerine benzer ve daha önce A. mexicanus'ta etkili bir şekilde çalıştığı gösterilmiştir.
- Çeviri engelleme tasarımı morpholinos
not: Translasyonu bloke eden morfolinolar, endojen başlangıç bölgesine bağlanarak translasyonu bloke eder ve translasyon mekanizmasının mRNA dizisini sterik engel yoluyla bağlamasını engeller.
1. ATG başlangıç sitesinden başlayarak hedef genin kodlama bölgesini tanımlayın.
2. Hedef dizinin ilk 25 baz çiftini, diziyi bir metin düzenleyiciye veya laboratuvar not defterine kopyalayıp yapıştırarak kaydedin.
3. Çevrimiçi yazılım (örneğin, http://reverse-complement.com) veya manuel çeviri kullanarak, hedef dizinin ters tamamlayıcısını oluşturun. Elde edilen ters tamamlayıcıyı bir metin düzenleyicisine veya laboratuvar not defterine kaydedin.
4. Morfolino oligonükleotidleri üreten bir şirketten ters kompleman dizisine sahip bir morfolino sipariş edin. Şirketler için Malzeme Tablosuna bakın.
2. Mikroenjeksiyonlar
- Enjeksiyonlar için genel aletlerin hazırlanması
not: Bu bölümdeki prosedürler başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklanmıştır ve burada küçük değişiklikler içeren bir genel bakış sunulmaktadır.
- Balık sistemi suyunda çözülmüş ılık% 3'lük agarozu 100 mL'lik bir Petri kabına dökerek enjeksiyon plakaları oluşturun. Balık yumurtaları için kuyu yapmak için taze dökülmüş agarozun içine dikkatlice bir yumurta enjeksiyon kalıbı yerleştirin. Kalıbın yan tarafını 45°'lik bir açıyla agarın içine yerleştirin ve ardından yavaşça agarozun içine indirin; Kalıbı belirli bir açıyla yavaşça indirmek, kalıbın altında hava sıkışmasını önler. Agaroz katılaştıktan sonra kalıbı yavaşça çıkarın. Plakalar 4 °C'de 1 haftaya kadar kapalı olarak saklanabilir.
- Tek hücreli aşamalı yumurtaların toplanması
- Üremenin beklendiği gece, tankları her 15-30 dakikada bir inceleyin ve tankın dibindeki yumurtaları izleyin. Yumurtalar yarı saydam görünür ve çapı yaklaşık 1 mm'dir.
- Yumurtaları toplamak için ince gözenekli bir balık ağı kullanın ve bunları taze balık sistemi suyuyla dolu bir cam kaseye aktarın. Yumurtaların tek hücre aşamasında olduğunu doğrulamak için yumurtaları mikroskop altında inceleyin.
- Cam pipetler kullanarak, tek hücreli yumurtaları enjeksiyon plakalarına aktarın. Yumurtalar plastiğe yapışacağı için bu aşamada cam pipetlere ihtiyaç duyulur.
- Bir pipet kullanarak, yumurtaları bölüm 2.1'deki agaroz enjeksiyon plakasının kuyucuklarına dikkatlice bırakın. Önceden ısıtılmış (oda sıcaklığında) enjeksiyon plakasının sıralarını maksimum sayıda yumurta ile doldurun (sıra başına 30-40 ve en fazla beş sıra). Tam sıralar, enjeksiyonlar sırasında yumurtaların hareket etmesini önlemeye yardımcı olur. Enjeksiyonların performansı gerçekleşene kadar yumurtaları enjeksiyon plakasında az miktarda balık sistemi suyu ile nemlendirin.
- Piko-enjeksiyon kurulumu ve genel enjeksiyon optimizasyon yönergeleri
- Kılcal damarın içine uyan jel yüklemeli pipet uçları kullanarak veya standart mikropipet uçları kullanarak ve sonuna 2-4 μL bolus ekleyerek enjeksiyon iğnelerini geri doldurun. İğne doldurulduktan sonra, enjeksiyon iğnesindeki fazla uzunluğu kesmek için forseps kullanın.
- Bir pikolitre mikroenjektöre bağlı bir mikromanipülatöre monte edilmiş bir iğne kullanarak mikroenjeksiyonlar yapın.
- Enjeksiyon süresini 0,03 saniyeye ve basıncı ~0,0 psi'ye ayarlayın. Enjeksiyon basıncı, iğneler arasındaki küçük farklılıklara göre değişecektir, bu nedenle ~ 1.0 nL enjeksiyon bolusu elde etmek için optimize edin.
not: Enjeksiyon basıncı genellikle ~10–30 psi aralığındadır.
- ~1–1.5 nL'lik bir enjeksiyon hacmi elde etmek için mineral yağa enjekte ederek ve bolus boyutunu bir slayt mikrometre ile ölçerek enjeksiyon bolusunu standartlaştırın. Bolus hacmini artırmak veya azaltmak için enjeksiyon basıncını (psi) ayarlayın.
- Bir laboratuvar mendili kullanarak yumurtaların en üstünden su çekin.
not: Astyanax yumurta koryonu, zebra balığı yumurtalarından biraz daha zordur. Yumurtaların üst kısmından su çekmenin, yumurtaya iğne girmesini kolaylaştırmaya yardımcı olduğunu bulduk. Plaka optimizasyonu, tek bir tabakta ~ 200 yumurtaya izin verebilir.
- Her bir yumurtaya iğne ile nüfuz etmek için mikromanipülatörü kullanın ve doğrudan yumurta sarısına enjekte edin. Sarısı içine yerleştirildikten sonra, enjeksiyon düğmesine veya enjeksiyon ayak pedalına basarak yumurtayı enjekte edin.
not: ~ 15 dakika içinde tam bir plaka enjekte edilebilir. Tek hücreli aşama ~ 40 dakika sürer.
- Morfolinos
enjeksiyonu
not: Toksisiteye neden olmadan nakavt için gerekli olan morfolino miktarının gen hedefine göre optimize edilmesi gerekecektir; Bununla birlikte, 400 pg'lik bir konsantrasyon başlamak için iyi bir yerdir.
- Morfolino'yu yumurta başına 400 pg morpholino enjekte edilecek şekilde hazırlayın. Morfolino'yu buz üzerinde çözdürün. Enjeksiyon çözeltisi, morfolino (istenen konsantrasyonda), RNaz içermeyen H2O veya Danieau çözeltisi ve fenol kırmızısından (nihai hacmin% 10'u) oluşur. Bir örnek için Tablo 1'e bakın.
- Embriyo başına 1 nL enjekte edin.