Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Mikroenjeksiyon
- Enjeksiyondan öğleden sonra en az 2 erkek ve 2 dişi ile 4-6 üreme tankı kurun. Bu balıklar öğleden sonra beslenmemelidir. Bu adım, balık atığı miktarını azaltacak ve ertesi sabah onları temizlemek için zaman kazandıracak, aynı zamanda bir üreme tepkisi oluşturmaya yardımcı olacaktır.
- Ertesi sabah, aşağıdakilerden oluşan hazırlanmış enjeksiyon solüsyonunu çıkarın: (i) bir zebra balığı ubikitin promotörü ve floresan voltaj gösterge geni Hızlandırılmış Aksiyon Potansiyelleri Sensörü 1 (ASAP1) içeren bir Tol2 transpozon yapısı ve (ii) Tol2 mRNA, -80 °C dondurucudan ve buzun üzerine yerleştirin.
- Balık yetiştirme tanklarındaki bölücüleri çekin ve balıkların çiftleşmesine izin verin. Genel olarak, balıklar bölücüyü çıkardıktan sonra 20-30 dakika içinde yumurta bırakırlar. Değilse, 1-2 saat daha bekleyin. Bazı balıklar hiç yumurta bırakmayabilir. Bu durumda, balık embriyosu toplama için bu deneyi tekrarlayın.
- Beklerken, forseps ile eğimli bir kenar oluşturacak şekilde ucu kırılarak veya hassas bir görev sileceği üzerinde kırılarak hazırlanmış iğneler olduğundan emin olun.
- Aşağıdaki parametreleri kullanarak iğneleri bir mikropipet çektirme üzerindeki kılcal camdan çekin: ısı 545; çekme 60; hız 80; zaman 250; basınç 500. Forsepsleri yaklaşık 45°'lik bir açıyla tutarak bir diseksiyon dürbününün altında (çap tahmini için göz merceği cetveli ile) forseps ile iğneyi kırın. İstenilen iğne çapları mikroenjektör ayarlarına bağlı olarak değişebilir ancak embriyo mortalitesini azaltmak için daha küçük çap tercih edilir.
- Balıklar yumurtladıktan sonra, onları 10 cm çapında bir Petri kabında toplayın ve diseksiyon kapsamına getirin. Tüm anormal embriyoları ve balık atıklarını çıkarın.
- Döllenmiş embriyoları hazırlanan% 3 agaroz enjeksiyon kalıbına pipetleyin. Embriyoların yerinde kalmasına yardımcı olmak için fazla suyu alın.
- Tüm sıralar canlı embriyolarla doldurulduktan sonra, bunları, tek hücrelerin tümü iğneye doğru aynı yöne bakacak şekilde düzenleyin, bu da yatay olarak yaklaşık 45 ° 'lik bir açıdır. Bu, enjeksiyonu daha sonra çok daha kolay hale getirecektir.
- Eldiven giyerken, 20 μL'lik bir yükleme pipet ucu kullanın ve hazırlanan yapının 5 μL'sini buz üzerindeki tüpten çıkarın.
- Ucu, reaktifi uca en yakın hale getirmek için, kırık kılcal borunun arka ucuna, dokunmaya başladığı yere kadar dikkatlice yerleştirin. Hala hava kabarcıkları varsa, ucu kırmamaya dikkat ederek iğneyi sallayın.
- İğneyi doğrudan mikroenjeksiyon iğne tutucusuna yerleştirin ve iğne yerinde kalana kadar dikkatlice sıkın. Açıyı yaklaşık 45°'ye ayarlayın.
- İğne hazırlanıp takıldıktan sonra mikroskobu ve gaz basınç tankını açın. Ticari CO2 tankları genellikle bu amaç için iyidir. Enjeksiyon hacmi, tutma ve çıkarma basıncı ile ayarlanır: tutma için yaklaşık 0,5 psi ve fırlatma için 30 psi. Pedala basarken solüsyonun çıkıp çıkmadığını kontrol ettiğinizden emin olun.
- Bir damla mineral yağ içeren bir aşama mikrometresi kullanarak, çözeltinin hacmini ve akışını ~ 150 μm çapa (yaklaşık 2 nL) ayarlayın. Karşı basıncın iğneden küçük bir miktar damlamasına izin vereceğinden emin olun. Yeterli geri basınç yoksa, kılcal hareket sıvının iğneye girmesine ve mRNA'nın tahrip olmasına neden olur.
- İğne kalibre edildikten sonra, yapıyı döllenmiş embriyoların tek hücresine enjekte etmeye başlayın.
not: Bu, hücre zarının delinmesi zor olduğu için büyük miktarda pratik, sabır ve incelik gerektirir. Transgenik zebra balığı oluşturmak için çözeltinin yumurta sarısına değil hücreye enjekte edilmesi önemlidir. Bu morfolino enjeksiyonundan farklıdır. Yapı hücre içinde gittiği sürece iğnenin hücreye hangi taraftan girdiği önemli değildir. Transgenez, hücre yerine yumurta sarısına enjekte edilirse çok düşük bir başarı oranına sahip olacaktır. Tek hücreli aşamalı enjeksiyon da önemlidir, aksi takdirde somatik kimera balığı yaratılacaktır. Bu, transgenin germ hücrelerine girme şansını azaltacaktır.
- Embriyoyu yerinde tutan ve iğnenin embriyoyu hareket ettirmeden basınç uygulamasına izin veren bir destek sağlamak için jel çentiğinin kenarını kullanın. İğnenin ucu tek hücreye girdikten sonra, istenen miktarda çözeltiyi serbest bırakmak için pedala basın. Bu işlemi tüm embriyolar için tekrarlayın.
- Tamamlandığında, enjekte edilen embriyoları, agaroz çentiğinden balık sistemi suyu ve tek kullanımlık 3.4 mL transfer pipeti ile durulayarak etiketli bir tabağa aktarın. Embriyoları gelişmelerine izin vermek için 28,5 ° C'lik bir inkübatörde saklayın.
