İnsan iPSC'lerinde PiggyBac Transpozon Aracılı Gen Düzenleme: PiggyBac Transpozon Sistemi Kullanılarak İnsan iPSC'lerine İlgilenilen Geni Entegre Etme Prosedürü

Özet

Kaynak: Garone, M. G. et al. İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin (iPSC'ler) PiggyBac Vektörleri Kullanılarak Fonksiyonel Spinal ve Kraniyal Motor Nöronlara Dönüştürülmesi. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, soya özgü transkripsiyon faktörlerinin ektopik ekspresyonu ile PiggyBac transpozon sistemi ile insan iPSC'lerinin transfeksiyonu yoluyla motor nöronlar üretme prosedürünü göstermektedir.

Protokol

1. NIL ve NIP ile İndüklenebilir iPSC Hatlarının Oluşturulması

1. Hücre transfeksiyonu
   1. Hücreleri PBS ile durulayın (Ca^{2 +} / Mg^{2 +} ücretsiz).
   2. Hücre ayrışma reaktifi ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) (35 mm'lik bir tabak için 0,35 mL) ve tek hücreler olana kadar 37 ° C'de inkübe edin
   3. ayrılmış (5-10 dk).
   4. P1000 pipetleyici ile 3-4 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre ayrımını nazikçe tamamlayın.
   5. 15 mL'lik bir tüpte toplayın ve 10 mL'ye PBS (Ca^{2 + /} Mg^{2 +} ücretsiz) ekleyin. Hücreleri sayın.
   6. 10⁶ hücreyi pelet haline getirin ve 100 μl Tampon R içinde yeniden süspanse edin (hücre elektroporasyon kitine dahildir, bkz. Malzeme Tablosu).
   7. Transfeksiyon için plazmit DNA ekleyin: 4.5 μg transpoze vektör (epB-Bsd-TT-NIL veya epB-Bsd-TT-NIP) ve 0.5 μg piggyBac transpozaz plazmiti.
   8. Hücre elektroporasyon sistemi ile (Malzeme Tablosuna bakın) üreticinin talimatlarına göre aşağıdaki parametrelerle geçiş yapın: 1.200 V voltaj, 30 ms genişlik, 1 darbe. Hücreleri, 6 mm'lik matris kaplı bir tabakta 10 μM Y-27632 (ROCK inhibitörü, Malzeme Tablosuna bakınız) ile takviye edilmiş insan iPSC ortamında tohumlayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
B27	Miltenyi Biyotec	130-093-566	Nöronal hücre bakımı için serum içermeyen takviye
Bambanker	Nippon Genetiği	NGE-BB02	Motor nöron progenitörleri için hücre dondurma ortamı
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881 Serisi	Elektrofizyolojik çözeltiler için kimyasallar
Corning Matrigel hESC Nitelikli Matris	Corning	354277	Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) fare sarkomundan sulandırılmış bazal membran hazırlığı. iPSC'nin plastik ve cam desteklere yapıştırılması için kullanılır
CRYOSTEM ACF DONDURMA ORTAMI	Biyolojik Endüstriler	05-710-1E	İnsan iPSC'ler için dondurma ortamı
Dağıtma	Gibco (Gibco)	17105-041	İnsan iPSC'lerinin nazikçe ayrışması için reaktif
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D6421-500ML	Hücre kültürü için bazal ortam
Doksisiklin	Sigma-Aldrich	D9891-1G	epB-Bsd-TT-NIL ve epB-Bsd-TT-NIP vektörlerinden transgenlerin ekspresyonunu indüklemek için kullanılır
DS2U Serisi	Wi Hücresi	UWWC1-DS2U	Ticari insan iPSC hattı
GDNF (Yurt İçi Finans Santrali	PreproTech (Hazırlık Teknolojisi)	450-10	Glial kaynaklı nörotrofik faktör
Gibco Epizomal hiPSC Hattı	Thermo Fisher Bilimsel	A18945	Ticari insan iPSC hattı
Hepes Belediyesi	Sigma-Aldrich	H4034	Elektrofizyolojik çözeltiler için kimyasallar
Laminin	Sigma-Aldrich	11243217001	Sinir hücrelerinin in vitro olarak bağlanmasını ve büyümesini teşvik eder
NEAA (NEAA)	Thermo Fisher Bilimsel	11140035	Esansiyel olmayan amino asitler. Hücre büyümesini ve canlılığını artırmak için hücre kültürü ortamı için ek olarak kullanılır.
Neon 100 μL Takımı	Thermo Fisher Bilimsel	MPK10096	Hücre elektroporasyon kiti
Neon Transfeksiyon Sistemi	Thermo Fisher Bilimsel	MPK5000	Hücre elektroporasyon sistemi
Nörobazal Orta	Thermo Fisher Bilimsel	21103049	Astrosit besleyici tabakaya ihtiyaç duymadan nöronal hücre popülasyonlarının uzun süreli bakımı ve olgunlaşması için tasarlanmış bazal ortam
NutriStem-XF/FF	Biyolojik Endüstriler	05-100-1A	İnsan iPSC kültür ortamı
PBS Ca2 +/Mg2+ içermez	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Dulbecco'nun Fosfat Tampon Salin, Kalsiyumsuz, Magnezyumsuz
Penisilin / Streptomisin	Sigma-Aldrich	P4333-100ML	Bakterilerden hücre kültürü kontaminasyonunu önlemek için kullanılan penisilin / Streptomisin çözeltisi.
Y-27632 (KAYA inhibitörü)	Enzo Yaşam Bilimleri	ALX-270-333-M005	Rho ile ilişkili, sarmal bobin içeren protein kinazın (ROCK) hücre geçirgen seçici inhibitörü. iPSC'nin sağkalımını artırır

Sertifikası Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Serisi