$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. CRISPR-concatemer Vektörü için gRNA Tasarımı
NOT: Bu bölümün amacı, en iyi hedefleme stratejisinin nasıl seçileceğini ve CRISPR-birleştirici vektör için belirli çıkıntılar içeren gRNA'ların nasıl tasarlanacağını açıklamaktır.
- Tercih edilen bir CRISPR gRNA tasarım aracını kullanarak ilgilenilen genlere karşı gRNA'lar tasarlayın. Bir örnek için Malzeme Tablosuna bakın.
not: Bir çift paralog geni hedeflerken, gen başına bir gRNA tasarlamak mümkün olsa da, çift nakavt elde etme şansını artırmak için gen başına iki gRNA tasarlanması tavsiye edilir (Şekil 1).
- Bir kısıtlama haritalama aracı kullanarak gRNA'ların BbsI tanıma bölgesini içermediğinden emin olun (bir örnek için Malzeme Tablosuna bakın).
- Tablo 1'de gösterildiği gibi her oligoya belirli CRISPR birleştirici vektör çıkıntıları ekleyin.
2. gRNA'ların CRISPR birleştirici Vektörüne klonlanması
- Oligos
'un fosforilasyonu ve tavlanması
not: Bu adım, her bir gRNA oligo için üst ve alt ipliklerin nasıl tavlanacağını ve uçlarının tek bir reaksiyonda nasıl fosforile edileceğini gösterir.
- Aşağıdaki talimatlara göre oligoları fosforile etmek ve üst ve alt iplikleri buz üzerinde tavlamak için reaksiyon karışımını hazırlayın.
not: Tüm oligolar tek bir reaksiyonda toplanabilir; örneğin, 4 gRNA birleştirici vektör durumunda, 8 oligoyu bir araya getirin.
- 3 birleştirici için, 3.0 μL gRNA üst iplikçik (her gRNA'dan 1.0 μL; 10 μM, 1 μL/gRNA), 3.0 μL gRNA alt iplikçik (her gRNA'dan 1.0 μL; 10 μM, 1 μL/gRNA), 2.0 μL T4 DNA ligaz tamponu (10x), 1.0 μL T4 PNK kullanın ve toplam 20.0 μL hacme kadar H2O ekleyin.
- Pipetleyerek iyice karıştırın ve aşağıdaki ayarları kullanarak bir termodöngüleyicide çalıştırın: 37 °C 30 dakika, 95 °C 5 dakika, rampa 0,3 °C/dk'da 25 °C'ye düşürün, 4 °C'de tutun.
- BbsI karıştırma reaksiyonu
not: Bu bölümde, önceden tavlanmış gRNA oligoları, alternatif sindirim ve ligasyon döngüleri ile tek adımda birleştirici vektörün uygun konumuna dahil edilir.
- 3 ve 4 gRNA birleştirici vektörler oluşturmak için reaksiyon karışımını DNase/RNaz içermeyen suda 1:100 oranında seyreltin.
not: 2 gRNA birleştiricisini klonlarken bu adıma gerek yoktur.
- BbsI karıştırma reaksiyonunu aşağıdaki talimatlara göre buz üzerinde birleştirin. Yalnızca vektörü içeren bir negatif denetim ekleyin.
- 100 ng CRISPR-birleştirici vektör, 10.0 μL oligo karışımı, 1.0 μL BSA içeren kısıtlama enzimi tamponu (10x), 1.0 μL DTT (10 mM), 1.0 μL ATP (10 mM), 1.0 μL BbsI, 1.0 μL T7 ligaz ve toplam 20.0 μL hacme kadar H2O kullanın.
- Pipetleyerek iyice karıştırın ve aşağıdaki ayarları kullanarak bunu bir termodöngüleyicide çalıştırın: 3 ve 4 gRNA birleştiricisini klonlamak için 50 döngü ve 2 gRNA birleştirici için 25 döngü, her ikisi de 37 °C'de 5 dakika, 21 °C'de 5 dakika, 37 °C'de 15 dakika, ardından sonsuza kadar 4 °C'de tutun.
- Eksonükleaz tedavisi
not: Bu adım, doğrusallaştırılmış DNA izlerini ortadan kaldırarak klonlamanın verimliliğini artırdığı için şiddetle tavsiye edilir.
- BbsI karıştırma reaksiyonunu bir DNA eksonükleaz ile tedavi edin (Malzeme Tablosuna bakınız) aşağıdaki gibi.
- Önceki adımdan (2.2.3) 11.0 μL ligasyon karışımı alın, 1.5 μL eksonükleaz tamponu (10x), 1.5 μL ATP (10 mM), 1.0 μL DNA eksonükleaz ekleyin ve su ile toplam hacmi 15.0 μL'ye getirin. 37 ° C'de 30 dakika, ardından 70 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
not: Bu adım, karışımdaki herhangi bir kalıntı doğrusallaştırılmış DNA'yı uzaklaştırır ve böylece klonlama verimliliğini artırır.
- Isı şoku ile kimyasal olarak yetkin E. coli bakterisine dönüşüm için 2 μL reaksiyon karışımı kullanın.
NOT: Alternatif olarak, reaksiyon -20 °C'de bir haftaya kadar saklanabilir.
3. Bağırsak Organoidlerinin Elektroporasyon ile Transfeksiyonu
NOT: Lütfen bu prosedürün Fujii ve ark. 2015 yılında fare ince bağırsak organoid kültürleri için adaptasyon ile yayınlanan protokole dayanmaktadır.
- Ön elektroporasyon
not: Bu bölümde, tüm antibiyotiklerin ve şartlandırılmış ortamların kültür ortamlarından çıkarılmasıyla elektroporasyondan önce fare bağırsak organoidlerinin nasıl hazırlanacağı açıklanmaktadır. Bu, elektroporasyon sırasında olası toksik etkileri önleyecektir.
- Transfeksiyon prosedürünün 0. gününde, organoidleri 1: 2 oranında bölün.
NOT: Bağırsak organoid kültürleri, daha önce belirlenmiş protokollere göre kript izolasyonu yapılarak elde edilebilir. Tüm medya kompozisyonları için lütfen Tablo 2'ye bakın.
- Elektroporasyon için organoidleri ayırırken, transfeksiyon başına en az 6 oyuklu 48 oyuklu bir plaka tohumlayın.
- Organoidleri 20 μL-bazlık matris damlalarında tohumlayın ve bunları WENR + Nic ortamında (Wnt + EGF + Noggin + R-spondin + Nikotinamid) 37 ° C'de,% 5 CO2 nemlendirilmiş bir inkübatörde (daha önce tarif edildiği gibi) büyütün.
- 2. günde, WENR + Nic'i antibiyotiksiz 250 μL EN (EGF + Noggin) + CHIR99021 (Glikojen Sentaz Kinaz-3 inhibitörü) + Y-27632 (ROCK inhibitörü) ile değiştirerek ortamı değiştirin (bkz. Tablo 2).
NOT: Tüm adımlarda, 48 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna eklenen ortam miktarı 250 μL'dir.
- 3. günde, organoid ortamı antibiyotik olmadan EN + CHIR99021 + Y-27632 +% 1.25 v / v Dimetil sülfoksit (DMSO) olarak değiştirin.
- Hücrelerin hazırlanması
not: Burada organoidlerin mekanik ve kimyasal ayrışma yoluyla küçük hücre kümelerine nasıl parçalanacağını açıklıyoruz. Bu adımlar, prosedürün başarısı için kritik öneme sahiptir.
- 4. günde, 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak bodrum matris kubbelerini bozun ve organoidleri 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. 48 oyuklu bir plakanın dört kuyusunun havuz içeriğini bir tüpe dönüştürün.
- Bir P200 pipeti ile yaklaşık 200 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek organoidleri mekanik olarak küçük parçalara ayırın. Oda sıcaklığında santrifüjleyin, 600 x g'da 5 dakika.
- Ortamı çıkarın ve peleti 1 mL hücre kültürü dereceli rekombinant proteaz içinde yeniden süspanse edin (malzeme tablosuna bakın). 37 ° C'de en fazla 5 dakika inkübe edin ve ardından 50 μL'lik bir numune damlasını 4x objektif ile ters çevrilmiş ışık mikroskobu altında kontrol edin.
not: 10-15 hücreli kümeler arzu edilir, çünkü bu, elektroporasyondan sonra hücre sağkalımını arttırır.
- Hücre süspansiyonunu düşük bağlayıcı 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve antibiyotiksiz 9 mL bazal ortam ekleyerek ayrışmayı durdurun (bakınız Tablo 2). Oda sıcaklığında, 600 x g'da 5 dakika santrifüjleyin, ardından süpernatanı atın ve peleti 1 mL indirgenmiş serum ortamında yeniden süspanse edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Bürker hazneli hücre sayısını sayın ve elektroporasyon reaksiyonu başına en az 1 x 105 hücre kullanın. 15 mL'lik tüpe 9 mL indirgenmiş serum ortamı ekleyin ve oda sıcaklığında, 400 x g'da 3 dakika santrifüjleyin.
- Elektroporasyon
not: Aşağıdaki bölümler, elektroporasyonun nasıl gerçekleştirileceği ve organoidlerin daha sonra nasıl geri kazanılacağı hakkında talimatlar sağlar.
- Tüm süpernatanı çıkarın ve peleti bir elektroporasyon solüsyonunda yeniden süspanse edin (Malzeme Tablosuna bakınız). Hücre süspansiyonuna toplam 10 μg DNA ekleyin ve 100 μL'lik son hacme elektroporasyon solüsyonu ekleyin ve hücre-DNA karışımını buz üzerinde tutun. CRISPR-concatamer vektörlerini 1:1 oranında bir Cas9 ekspresyon plazmidi (örneğin, Addgene #41815) ile birlikte kullanın.
not: Eklenen DNA'nın toplam hacmi, toplam reaksiyon hacminin% 10'una eşit veya daha az olmalıdır.
- Transfeksiyon verimliliğini değerlendirmek için bir GFP plazmidi içeren ayrı bir transfeksiyon karışımı ekleyin (ör., pCMV-GFP, Addgene #11153 veya herhangi bir jenerik GFP eksprese eden plazmit).
- Hücre-DNA karışımını elektroporasyon küvetine ekleyin ve elektroporatör odasına yerleştirin. Elektroporatör üzerindeki uygun düğmeye basarak empedansı ölçün ve 0.030-0.055 kΩ olduğundan emin olun. Tablo 3.
'da gösterilen ayarlara göre elektroporasyon gerçekleştirin
not: Empedans değeri izin verilen aralığın dışına çıkarsa, küvetteki çözelti hacmini ayarlayın.
- Küvete 400 μL elektroporasyon tamponu + Y-27632 ekleyin ve ardından hepsini 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın. Hücrelerin iyileşmesine izin vermek için oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin ve ardından oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 400 x g'da döndürün.
- Süpernatanı çıkarın ve peleti 20 μL/kuyu bazal matrisinde yeniden süspanse edin. 48 oyuklu bir plakada oyuk başına yaklaşık 1 x 104 ila 1 x 105 hücre tohumlayın ve EN + CHIR99021 + Y-27632 +% 1.25 v / v DMSO ortamı ekleyin. 37 °C'de inkübe edin.
- 5. günde, ortamı EN + CHIR99021 + Y-27632 olarak değiştirin ve GFP ifadesini gözlemleyerek transfeksiyon verimliliğini kontrol edin (Şekil 2). Organoidleri 37 °C'de tutun ve 2 gün sonra EN + CHIR99021 + Y-27632 ortamını yenileyin.
- 9. günde, ortamı WENR + Nic + Y-27632 olarak değiştirin ve 37 °C'de inkübe edin.
not: Y-27632 7-10 gün sonra (16-19. günlerde) çıkarılabilir.
| Kaset 1 | Kaset 2 | Kaset 3 | Kaset 4 |
| Sıra (5′-3′) | CACCGG[gRNA1]GT | ACCGG[gRNA2]G | CCGG[gRNA3] | ACACCGG[gRNA4]GTT |
| Sıra (5′-3′) | TAAAAC[RC-gRNA1]CC | AAAAC[RC-gRNA2]C | AAAC[RC-gRNA3] | CTAAAAC[RC-gRNA4]CCG |
Tablo 1: CRISPR birleştirici vektörünün her kaseti için çıkıntılar.
saklayın
saklayın
| Bazal ortam | | Yorum |
| 4 °C'de 4 hafta saklayın | | |
| Hücre kültürü ortamı | 500 mL | Malzeme tablosuna bakın |
| L-Glutamin | 100 adet 5 mL | |
| Tamponlama maddesi 1 M | 5 mL | Malzeme tablosuna bakın |
| Penisilin Streptomisin | 100 adet 5 mL | |
| WENR + Nic (Wnt + EGF + Noggin + Rspondin + Nikotinamid) | | |
| 4 °C'de 2 hafta | | |
| Bazal ortam | 50 mL'ye kadar | |
| Nöronal hücre serumu içermeyen takviye (50x) | 1 mL | Malzeme tablosuna bakın |
| Nöronal hücre serumu içermeyen takviye (100x) | 500 μL | Malzeme tablosuna bakın |
| n-Asetilsistein (500 mM) | 125 μL | |
| fare EGF (100 μg/mL) | 25 μL | |
| fare Noggin (100 μg/mL) | 50 μL | |
| R-Spondin şartlandırılmış ortam | 5 mL | |
| Wnt3a şartlandırılmış ortam | 25 mL | |
| Nikotinamid (1 M) | 250 μL | |
| EN + CHIR + Y-27632 (EGF + Noggin + CHIR + Y-27632) | | |
| 4 °C'de 2 hafta | | |
| Penisilin Streptomisin içermeyen bazal ortam | 20 mL'ye kadar | |
| Nöronal hücre serumu içermeyen takviye (50x) | 400 μL | Malzeme tablosuna bakın |
| Nöronal hücre serumu içermeyen takviye (100x) | 200 μL | Malzeme tablosuna bakın |
| n-Asetilsistein (500 mM) | 50 μL | |
| fare EGF (100 μg/mL) | 10 μL | |
| fare Noggin (100 μg/mL) | 20 μL | |
| Y-27632 (10 μM) | 20 μL | |
| CHIR99021 (8 μM) | 10 μL | |
| EN (EGF + Noggin) | | |
| 4 °C'de 4 hafta saklayın | | |
| Bazal ortam | 50 mL'ye kadar | |
| Nöronal hücre serumu içermeyen takviye (50x) | 1 mL | Malzeme tablosuna bakın |
| Nöronal hücre serumu içermeyen takviye (100x) | 500 μL | Malzeme tablosuna bakın |
| n-Asetilsistein (500 mM) | 125 μL | |
| fare EGF (100 μg/mL) | 25 μL | |
| fare Noggin (100 μg/mL) | 50 μL | |
Tablo 2: Organoid Medya Bileşimi.
| Gözenekli nabız | Nabız aktar |
| gerilim | 175V | 20V |
| Darbe uzunluğu | 5 milisaniye | 50 milisaniye |
| Nabız aralığı | 50 milisaniye | 50 milisaniye |
| Darbe sayısı | 2 | 5 |
| Bozunma oranı | %10 | %40 |
| Po -larite | + | +/- |
Tablo 3: Elektroporasyon Ayarları.
