$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Yazılımın Yüklenmesi
- Yazılımı https://github.com/bsbrl/Autoinjector'dan yüklemek için talimatları izleyin.
2. Reaktiflerin ve Pipetlerin Hazırlanması
- Agaroz: İki ayrı 200 mL cam şişede sırasıyla 3 g geniş aralıklı agaroz ve 3 g düşük erime noktalı agarozu 100 mL hücre kültürü dereceli PBS içinde ayrı ayrı çözerek %3 agaroz hazırlayın. Oda sıcaklığında 3 aya kadar saklayın.
- Tyrode çözeltisi: 1 g sodyum bikarbonat ve Tyrode tuzunu (tüm şişenin içeriğini kullanın) ve 13 mL 1 M HEPES'i 1 L damıtılmış suda çözün. PH'ı 7.4'e ayarlayın. Çözeltiyi 0,2 μm'lik bir şişe üstü filtreden süzün.
- Dilim kültürü ortamı (SCM): 10 mL sıçan serumu, 1 mL 2 mM glutamin, 1 mL penisilin-streptomisin (100x), 1 mL N-2 takviyesi (100x), 2 mL B27 takviyesi (50x) ve 1 mL HEPES (pH 7.3) tamponu 84 mL Nörobazal ortama ekleyin. 5 mL SCM'yi 15 mL'lik tüplere alın. -20 °C'de saklayın.
- CO2 Bağımsız Mikroenjeksiyon Ortamı (CIMM): Tozu 200 mL damıtılmış suda çözerek 5x DMEM modifiye edilmiş düşük glikozlu çözelti (fenol kırmızısı olmadan) hazırlayın. Çözeltiyi 0,2 μm'lik bir şişe üstü filtreden süzün (DMEM tozu için tüm şişenin içeriğini kullanın). 100 mL CIMM hazırlamak için 20 mL 5x DMEM modifiye solüsyonu, 1 mL HEPES tamponu, 1 mL N2 takviyesi (100x), 2 mL B27 takviyesi (50x), 1 mL penisilin-streptomisin (100x), 1 mL 2 mM glutamin ve 74 mL damıtılmış suyu karıştırın. Solüsyonu 4 °C'de saklayın.
- Sulandırma tamponu: 262 mM NaHCO₃, 0.05 N NaOH, 200 mM HEPE'yi damıtılmış suda çözerek sulandırma tamponunu hazırlayın. Çözeltiyi, şişe üstü 0,22 μm filtre sisteminden steril bir cam şişeye süzülerek sterilize edin. 500 μL sulandırma tamponunu hava geçirmez mikrosantrifüj tüplerine aliquot. 4 °C'de saklayın.
- Mikroenjeksiyon boya stoğu: Floresan etiketli Dekstran'ı RNaz içermeyen damıtılmış suda (son konsantrasyon 10 μg/μL) çözün. 5 μL alikot hazırlayın ve kullanana kadar -20 °C'de saklayın.
- Mikropipet çekiciyi kullanarak mikroenjeksiyon pipetlerini borosilikat cam kılcal damarlardan (1,2 mm dış çap, 0,94 mm iç çap) çekin. Pipetleri tozdan koruyun. Pipetleri 2-3 günden fazla saklamayın. Bu deney için çekme parametreleri HEAT idi: rampa sıcaklığı +1 – 5; ÇEKME: 100; VEL: 110; DEL: 100. HEAT ve VEL, pipetin şeklini ve boyutunu en çok etkileyen parametrelerdir.
not: Optimum mikroenjeksiyon pipeti, mikroenjeksiyon sırasında hücre hasarını önlemek için uzun ve esnek bir uca sahiptir.
>3. Doku Dilimi Hazırlama
- Beyin dokusu diseksiyonundan önce bir mikrodalga fırın kullanarak% 3 geniş aralıklı agarozu eritin. Gömmeden önce 37 ° C'de bir su banyosunda tutarak agarozun katılaşmasına izin vermeyin. Pipetlerin tozdan korunduğundan emin olun. Pipetleri 2-3 günden fazla saklamayın.
- Bir SCM alikotunu çözün ve 10-12 mL CIMM ve 20 mL Tyrode çözeltisini bir su banyosu kullanarak 37 ° C'ye ısıtın.
- Floresan izleyiciyi (Dextran-3000 veya Dextran-10000-Alexa konjuge; nihai konsantrasyon 5–10 μg/μL) enjekte edilecek diğer kimyasal(lar) ile karıştırın. Mikroenjeksiyon solüsyonunu 16.000 x g'da 4 ° C'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı toplayın ve yeni bir tüpe aktarın. Mikroenjeksiyon solüsyonunu kullanana kadar buz üzerinde tutun.
- Telensefalonun organotipik doku dilimlerini hazırlamak için E13.5–E16.5 fare embriyolarının kafalarını kullanın. Cildi çıkarın ve forsepsleri kullanarak kafatasını açın, orta hat boyunca hareket edin. Embriyonik beyni açık kafatasından çıkarın ve beynin ventral tarafından başlayarak beyin dokusunu kaplayan meninksleri çıkarın. Parçalanmış tüm beyni Tyrode solüsyonunda 37 °C'lik bir ısıtma bloğunda bırakın.
not: 3.4'te açıklanan tüm diseksiyon adımları, önceden ısıtılmış Tyrode çözeltisinde gerçekleştirilmelidir.
- Geniş aralıklı eritilmiş agarozu tek kullanımlık bir gömme kalıbına dökün. agaroz 38–39 °C'ye soğutulduğunda, beyinleri (en fazla 4 adet) bir Pasteur pipeti kullanarak dikkatlice içine aktarın. Bu adım için her zaman kesme ipuçlarını kullanın.
- Dokuya dokunmadan bir spatula veya bir çift Dumont #1 forseps kullanarak agarozu dokunun etrafında karıştırın. Agarozun oda sıcaklığında katılaşmasına izin verin. Agaroz katılaştıktan sonra, dokuyu çevreleyen fazla agarozu kesin.
- Tampon tepsisini PBS ile doldurun. Beyni, tepsiye dik olan dokunun rostro-kaudal ekseni ile yönlendirin (beynin rostral kısmını temsil eden koku soğancıklarını yer işareti olarak kullanın). Bir vibratom kullanarak 250 μm'lik dilimler kesin.
- 3,5 cm'lik bir Petri kabını 2 mL önceden ısıtılmış ortamla doldurun. Plastik bir Pasteur pipeti kullanarak dilimleri (10-15) bu tabağa aktarın. Bittiğinde, dilimlerle birlikte Petri kabını dilim kültürü inkübatörüne kaydırın. Dilimleri kullanana kadar %40O2 / %5 CO2 / %55N2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de tutun.
4. Mikroenjeksiyon
- Bilgisayarı, mikroskobu, mikroskop kamerasını, manipülatörleri, basınç teçhizatını ve basınç sensörünü açın. GitHub'dan indirilen ana klasördeki "launchapp.py" dosyasına tıklayarak uygulamayı yükleyin ve açılan ekranda cihaz ayarlarını belirtin (yükleme talimatları için adım 1.1'e bakın).
- Pipeti solüsyona daldırmadan önce istenmeyen tıkanmaları önlemek için dışa doğru bir basınç oluşturun. Pipete basınç uygulamak için dengeleme basınç çubuğunu %24–45'e kaydırın ve Değerleri Ayarla'ya tıklayın. Ardından, mekanik basınç valfi düğmesini basınç sensörü tarafından gösterildiği gibi 1–2 PSI (69–138 mbar) konumuna çevirerek basıncı yeterli bir basınca ayarlayın.
- Dilimleri 2 mL önceden ısıtılmış CIMM içeren 3,5 cm'lik bir Petri kabına aktarın. Mikroenjekte edilecek dilimleri Petri kabının ortasına yerleştirin. Petri kabını önceden ısıtılmış (37 °C) mikroenjeksiyon aşamasına aktarın.
- Mikroenjeksiyon pipetini uzun uçlu bir plastik pipet kullanarak 1,4–1,6 μL mikroenjekte edilmiş solüsyonla (adım 3.3'ten itibaren) yükleyin. Mikroenjeksiyon pipetini pipet tutucusuna yerleştirin.
- Mikroskoptaki en düşük büyütmeyi kullanarak, dilimi odağa getirin ve mikropipeti, dilim hedefiyle aynı düzleme odaklanacak şekilde bu görüş alanına (FOV) yönlendirin. Uygulamada FOV'u görmek için mikroskobun çıkışını kameraya geçirin.
- Cihaz kalibrasyonunu başlatmak için arayüzün sol üst köşesindeki büyütme düğmesine tıklayın. Büyütmeyi seçmek için bir pencere açılacaktır. 10x büyütmeyi veya lensin ayarlandığı büyütmeyi (ör. 4x, 10x, 20x, 40x) seçin ve Tamam'a basın. Yazılım, dahili objektif merceğinin 10x (en yaygın objektif merceği büyütmesi) olduğunu varsayar.
- Mikroskobun mikrometrik tekerleğini kullanarak pipet ucunu yeniden odaklayın ve imleçle pipet ucunu tıklayın. Ardından, adım 1.1 düğmesine basın ve açılır pencerede Tamam'a basın. Pipet Y yönünde hareket edecektir. Pipetin ucuna tıklayın ve adım 1.2 düğmesine basın. Son olarak, Pipet açısı kutusuna 45 girin ve Ayarlanan açıya basın.
- İstenen parametreleri Otomatik mikroenjeksiyon kontrol paneline girin. Apikal progenitörlere mikroenjeksiyon için enjeksiyon mesafesini 20-40 μm'ye ve derinliği 10-15 μm'ye ayarlayın. Nöronlara mikroenjeksiyon için, enjeksiyon mesafesini bazal taraftan 30-40 μm ve hedeflenenin ne olduğuna bağlı olarak derinliği 10-30 μm olarak ayarlayın. Hızı her zaman %100'e ayarlayın. Değerleri ayarla'ya tıklayın.
not: Yaklaşma mesafesi, pipetin bir sonraki enjeksiyon mesafesine geçmeden önce dokudan çektiği mesafedir, derinlik, mikroenjeksiyonun dokuya girdiği derinliktir, aralık, sıralı enjeksiyonlar arasındaki çizgi boyunca olan mesafedir, hız, pipetin μm/s cinsinden hızıdır.
- Tıkla Kenar çiz düğmesine basın ve enjeksiyonun yörüngesini tanımlamak için imleci açılır pencerede istenen yörünge boyunca sürükleyin. Progenitör kök hücrelerin mikroenjekte edilmesi için telensefalon yüzeyinin ventral tarafı hedeflenir. Pipeti çizginin başına getirin ve pipetin ucunu tıklayın. Mikro enjeksiyonu başlatmak için Yörüngeyi çalıştır'a tıklayın. Hedeflenen her enjeksiyon düzlemi için bu adımı tekrarlayın (genellikle düzlem başına 40-75 enjeksiyon ile 3-4 düzlem için yapılır).