Hidrofilik Etkileşim Sıvı Kromatografisi: Hidrofilik Polar Analitleri Hidrofilik Boncuklar Kullanarak Ayırmak İçin Bir Teknik

Özet

Kaynak: Liu, D., et al. Ultra Performanslı Sıvı Kromatografisi ile İmmünoglobulin G N-Glikan Analizi. J. Vis. Uzm. (2020).

Bu video, hidrofilik etkileşim sıvı kromatografisi kullanılarak hidrofilik polar bileşiklerin ayrılması ilkesini göstermektedir. Bu teknik, N-glikanlar dahil olmak üzere çeşitli polar analitlerin saflaştırılmasına yardımcı olur.

Protokol

1. Hidrofilik etkileşim kromatografisi ve glikanların analizi

1. UPLC cihazlarının kondisyonlanması ve mobil fazların hazırlanması
   1. Çözücü A: 100 mM amonyum format (pH = 4.4), çözücü B: %100 asetonitril, çözücü C: %90 ultra saf su (%10 metanol) ve çözücü D: %50 metanol (ultra saf su) dahil olmak üzere mobil fazları hazırlayın.
   2. Mobil aşamaları kontrol etmek için yazılımı açın.
   3. UPLC cihazlarını 0,2 mL/dk akış hızında (%50 solvent B ve %50 solvent C) 30 dakika dengede, ardından 0,2 mL/dk akış hızında (%25 solvent A ve %75 solvent B) 20 dakika dengede yıkayın, ardından 0,4 mL/dk akış hızında dengeleyin.
2. 2-aminobenzamid (2-AB) ile önceden etiketlenmiş N-glikanları, 25 μL'lik bir %100 asetonitril ve ultra saf su karışımında 2: 1 oranında (h / v) çözün. Ardından, 5 dakika (4 ° C) boyunca 134 × g'da santrifüjleyin ve 10 μL etiketli N-glikanları UPLC cihazlarına yükleyin.
3. Etiketli N-glikanları 0.4 mL / dak akış hızında, 25 dakika boyunca% 75 ila% 62 asetonitril doğrusal gradyanı ile ayırın. Ardından, 60 ° C'de bir UPLC üzerinde dekstran kalibrasyon merdiveni / glikopeptid sütunu ile analitik bir çalışma gerçekleştirin (burada, numuneler enjeksiyondan önce 4 ° C'de tutulmuştur).
4. Sırasıyla 330 nm ve 420 nm uyarma ve emisyon dalga uzunluklarında N-glikan floresansını tespit edin.
5. Glikanları tepe konumuna ve tutma süresine göre entegre edin.
6. Her bir Glikan Zirvesinin (GP) / tüm Glikan Zirvelerinin (GP'ler) (yüzde, %) göreceli değerini aşağıdaki gibi hesaplayın: GP1: GP1/GP'ler*100, GP2: GP2/GP'ler*100, GP3: GP3/GP'ler*100, vb.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2-aminobenzamid, 2-AB	Sigma, Çin
Asetonitril	Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Çin
Amonyum format	Pekin Minruida Technology Co., Ltd.
Dekstran Kalibrasyon Merdiveni / Glikopeptid sütunu	Watts technology Co., Ltd, Çin
Güçlendirme 3.0	Su teknolojisi Co, Ltd, Amerika
GlycoProfile 2-AB Etiketleme kiti	Sigma, Çin
metanol	Huihai Keyi Technology Co., Ltd, Çin
Milli-Q saf su sayacı	Millipore Co, Ltd, Amerika	202-2AB
Transfer sıvı tabancası	Smer Fell Bilim ve Technology Co, Ltd, Çin	Avantaj A10
Ultra düşük sıcaklıklı buzdolabı	Thermo Co., Ltd, Amerika	PB-10
Ultra performanslı sıvı kromatografisi	Watts technology Co., Ltd, Çin
Vakum Pompası	Watts technology Co., Ltd, Çin	4672100, 0.5-10μl ve 10-100μl ve 20-200μl ve 1000μl