$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Sialik Asitlerin Floresan Türevlendirilmesi
- 10 mL damıtılmış H₂O içinde 100 mg o-fenilendiamin ve 208 mg sodyum hidrojen sülfitten oluşan 10 mL OPD çözeltisi hazırlayın.
- Sialik asit numunelerine 20 μL OPD çözeltisi ekleyin. 30 saniye kuvvetlice vorteksleyin ve numuneleri karanlıkta 80 ° C'de 4 saat inkübe edin (yani mikrotüpleri alüminyum folyoya sarın).
- Numuneleri 5 dakika soğumaya bırakın, 80 μL damıtılmış H₂O ekleyin ve tüpleri 14.000 x g'da 1 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatandan 80 μL'yi 300 μL'lik yüksek geri kazanımlı bir HPLC şişesine aktarın. Türetilmiş sialik asit numuneleri 4-6 °C'de bir haftaya kadar saklanabilir.
2. Sialik Asit Türevlerinin HPLC Analizi
- Çevrimiçi bir floresan dedektörüne bağlı standart bir HPLC sistemi kullanarak numuneleri analiz edin.
- Analiz için 250 mm uzunluk ve 4,6 mm çap standart boyutlarına sahip ters fazlı bir C18 sütunu kullanın.
- 200 mL stok çözeltisini 800 mL LCMS dereceli su (LCMS - sıvı kromatografi kütle spektrometresi) ile seyrelterek çözücü A'yı hazırlayın. Stok çözeltisinin kendisi aşağıdaki gibi hazırlanabilir:
- 800 mL LCMS dereceli H₂O'ya 46 g formik asit ekleyin.
- Damla damla amonyum hidroksit çözeltisi (puriss. pa) ekleyerek pH'ı 4.5'e ayarlayın.
- Çözücüyü bir ölçüm silindirine aktarın ve 1.000 mL'ye kadar LCMS sınıfı H₂O ile doldurun. Bu stok çözeltisi 4-6 °C'de 3 aya kadar saklanabilir.
- Çözücü B için LCMS sınıfı asetonitril kullanın.
- Sialik asit türevlerini aşağıdaki gradyan elüsyonu ile 1 mL/dk akış hızında ayırın:
- Çözücü A'ya karıştırılmış çözücü B'nin %10'unu ekleyerek başlayın.
- 0 dakikadan 15 dakikaya kadar, doğrusal bir gradyanla çözücü B'nin oranını kademeli olarak% 60'a yükseltin.
- 15 dakikadan 16 dakikaya kadar, doğrusal bir gradyanla çözücü B'nin oranını %60'tan %90'a hızla artırın. Bu, HPLC kolonunun yıkanmasını başlatır.
- HPLC kolonunu daha fazla yıkamak için, çözücü B seviyesini 18 dakika ile 19 dakika arasında kademeli olarak tekrar %10'a düşürmeden önce çözücü B seviyesini 16 dakika ile 18 dakika arasında% 90'da tutun.
- HPLC kolonunu 19 ila 24 dakika arasında% 10 B başlangıç koşullarına yeniden dengeleyin.
- HPLC sistemine 50 μL numune enjekte edin.
- 373/448 nm'lik floresan dedektörü uyarma/emisyon dalga boylarını kullanarak eluentleri izleyin ve türetilmiş sialik asitlerin yaklaşık 9 dakika (Neu5Gc-OPD için) ve 10 dakika (Neu5Ac-OPD için) tutma sürelerinde beklenebilir.
- Neu5Ac (ANeu5Ac) ve Neu5Gc (ANeu5Gc) floresan tepe alanlarından Neu5Gc'nin (FNeu5Gc) nispi miktarını aşağıdaki gibi hesaplayın:
FNeu5Gc [%] = 100×ANeu5Gc/(ANeu5Ac+ANeu5Gc). Homozigot Cmah nakavt fareden alınan süt ve karaciğer örneklerinde FNeu5Gc %0 olması gerekirken, heterozigot ve vahşi tip farelerin FNeu5Gc değerleri, fare yaşına ve doku tipine (%2 ile %>90 arasında) bağlı olarak büyük ölçüde değişebilir ve beklenen hata payları %±12'dir.