Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Suyun yer değiştirmesini kullanarak embriyonik hacmin ölçülmesi
NOT: Bu protokolde döllenme sonrası 24 saat (hpf) embriyolar kullanılır (Şekil 1). Hacim ölçümlerinde kullanılan embriyolar etanol analizinde kullanılmaz.
- 10 embriyoyu ve ekstraembriyonik sıvıyı 250 μL hacimde işaretlenmiş 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin (Şekil 2A). 250 μL'lik doldurma hattına su ekleyin (Şekil 2B'deki boyalı su ile örneğe bakın).
- Koryonları çıkarılmış embriyolar için kaplar ayarlamak için adım 1.1'i tekrarlayın.
- Koryonu çıkarmak için, embriyoları 10 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) embriyo ortamında 2 mg / mL proteaz kokteyli ile 2 mg / mL proteaz kokteyli ile 100 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Her birkaç dakikada bir, koryonu kırmak için embriyoları hafifçe döndürün.
- Tüm embriyolar koryonlarından kurtulduktan sonra, dekoryonlu embriyoları proteaz kokteyli / embriyo ortamından çıkarın ve embriyoları yıkamak için taze embriyo ortamı ile 100 mm'lik yeni bir Petri kabına yerleştirin. Bu yıkama adımını 1 kez daha tekrarlayın (toplam 2 yıkama için). Embriyoları 100 mm'lik taze bir Petri kabına aktarın.
- Mümkün olan en küçük ucu kullanarak ve embriyolara zarar vermeden, bir p200 mikropipetleyici (Şekil 2C) kullanarak embriyoların etrafındaki tüm sıvıyı dikkatlice çıkarın ve suyu <0.1 mg hassasiyetle tartın. 10 embriyo örneğinin hacmini belirlemek için, 250 μL'den çıkarılan suyun ağırlığını / hacmini (1 mL su = 1 g su.) çıkarın. Tek bir embriyonun hacmini belirlemek için, 250 μL ile çıkarılan suyun ağırlığı arasındaki farkı 10.
2. Embriyoların etanol ile tedavi
edilmesi
- Çiftleşme tanklarından embriyoları toplayın ve standart 100 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Tek bir Petri kabı başına en fazla 100 embriyo sayın ve 28.5 ° C'de inkübe edin
not: Koryon çıkarılacaksa (adım 1.2), etanol eklemeden önce çıkarılması gerekir.
- 6 hpf'de, embriyo ortamı veya embriyo ortamı +% 1 etanol (h / h) ile yeni bir standart 100 mm Petri kabına 100'e kadar embriyo ekleyin. Petri kabını örtün, ancak KAPATMAYIN. Embriyoları 18 saat boyunca 28.5 ° C'ye ayarlanmış düşük sıcaklıklı bir inkübatöre yerleştirin veya embriyolar 24 hpf'lik gelişimsel zaman noktasına ulaşana kadar.
3. Embriyoları işlemeden önce kafa boşluğu gaz kromatografisi için iş akışının hazırlanması
- Tüm proteinleri denatüre etmek ve etanol metabolizmasını önlemek için su içinde 5 M NaCl'lik bir çözelti yapın (numune tüpü başına 450 μL gerekecektir). Proteaz kokteylini embriyo ortamında 2 mg / mL konsantrasyonda yapın.
- Her numune için 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpü ve 2 mL'lik bir gaz kromatograf şişesi etiketleyin. Aşağıda açıklanan etanol standartları için ek 2 mL gaz kromatograf şişelerinin yanı sıra hava, su ve 5 M NaCl / proteaz kokteyl boşluklarını etiketleyin.
- İkisi 50 μL'ye ve üçüncüsü 200 μL'ye ayarlanmış üç p200 mikropipetleyici; 450 μL'ye ayarlanmış bir p1000 mikropipetleyici ve 2 μL'ye ayarlanmış bir p2 mikropipetleyici. Embriyoları Petri kaplarından 1,5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerine aktarmak için kullanılan cam pipetler için, embriyoları pipete çekerken onlara zarar vermemek için kenarları düzleştirmek için pipet ucunu hızlı bir şekilde alevden geçirin.
4. Kafa boşluğu gaz kromatografisi için embriyoların işlenmesi
NOT: Hem koryonlarındaki embriyolar hem de daha önce koryonlarından çıkarılan embriyolar, seyreltme faktörlerinin hesaplanmasında tutarlılık için aynı şekilde muamele edilir.
- 50 μL'ye ayarlanmış iki p200 mikropipetleyiciyi kullanarak, birine 50 μL proteaz kokteyl solüsyonu çekin ve ikincisine 50 μL su çekin.
- Cam pipet ve mikropipetleyiciyi kullanarak, 10 embriyoyu (adım 2.2'den itibaren) 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne hızlı bir şekilde yerleştirin ve kapağı kapatın (Şekil 2A'da açıklandığı gibi). Test edilecek tüm numuneler, kontroller ve etanol ile muamele edilmiş embriyolar için tekrarlayın.
- 200 μL'ye ayarlanmış p200 mikropipetleyiciyi kullanarak, kapağı hızlı bir şekilde açın ve kalan tüm embriyo ortamını çıkarın (Şekil 2C'de açıklandığı gibi). 50 μL su içeren pipeti tüpe hızlı bir şekilde yerleştirin ve hızlı ama nazikçe (embriyolara zarar vermemek için) ekleyin, ardından suyu çıkarın. Bekleyen pipetörden hızlı bir şekilde 50 μL proteaz kokteyl solüsyonu ekleyin ve tüp kapağını kapatın (Şekil 2D).
not: Bu işlemi her seferinde bir örnek gerçekleştirin.
- Proteaz kokteylinin koryonu bozmasına izin vermek için numuneyi 10 dakika RT'de bekletin. Ardından, hızlı bir şekilde 450 μL 5 M NaCl ekleyin ve tüp kapağını kapatın (Şekil 2E). Numuneleri 10 dakika boyunca vorteksleyin. İşlemi hızlandırmak için, karıştırıcıyı aynı anda birden fazla numuneyi vorteksleyecek şekilde ayarlayın.
NOT: 24 hpf'den daha eski embriyoları olan herhangi bir tüpe az miktarda (~ 100 μL) silika boncuk karışımı (2 boy, 0,5 mm ve 1 mm boncuk) ekleyin. Daha yaşlı embriyolarda, notokord ne kadar süre homojenize olduklarına bakılmaksızın bozulmadan kalacaktır.
- 10 dakika homojenize ettikten sonra, 2 μL homojenize embriyo süpernatanı hızlı bir şekilde çıkarın ve bir gaz kromatograf şişesine ekleyin. Şişeyi politetrafloroetilen kapakla hızlı bir şekilde kapatın.
5. Besiyeri ve etanol standartlarının hazırlanması
- Ortam standartlarını hazırlamak için, ortamı 5 M NaCl/proteaz kokteyl çözeltisi ile 10 kat seyreltin. Her numuneden 2 μL'yi bir gaz kromatograf şişesine ekleyin ve bir politetrafloroetilen kapakla kapatın.
- Etanol standartlarını hazırlamak için, 5 M NaCl/proteaz kokteyl çözeltisinde aşağıdaki konsantrasyonlara kadar 0 etanolün seri seyreltmesini oluşturun: 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 ve 40 mM. Bir gaz kromatograf şişesine her standarttan 2 μL ekleyin ve bir politetrafloroetilen kapakla kapatın.
6. Kafa boşluğu gaz kromatografisinin hazırlanması
>NOT: Kafa boşluğu gaz kromatografisi, ayırma için değil, etanol seviyelerini ölçmek için kullanılır.
- Otomatik numune alma cihazının ısıtıcısını 58 °C'ye ayarlayın ve açın. Isıtıcının 58 °C'ye ulaşmasına izin verin ve gaz kromatografını besleyen hava ve hidrojen gazı hatlarını açın (etanolü ölçmek için kullanılan alev iyonizasyonu için).
NOT: Psi, kromatografı üreticinin spesifikasyonlarına göre düzgün şekilde çalıştıracak şekilde ayarlanmalıdır. Helyum hattının açık olduğundan ve uygun psi'ye ayarlandığından emin olun.
- Septum için enjekte edilen numune sayısının >100 olmadığından emin olun. Enjeksiyon lifi için, enjekte edilen numune sayısının >500.
olmadığından emin olun.
NOT: Her ikisi de enjeksiyon miktarını aşıyorsa, test numunelerini çalıştırmadan önce değiştirilmeleri gerekecektir.
- Analiz yazılımını açın ve iş istasyonunun doğru şekilde kurulduğundan emin olun. Tüm verileri laboratuvar/departman standartlarına göre saklayın. Çalıştırılacak örnekler için yeni bir örnek listesi oluşturun.
- Başlatma yöntemini başlatın ve numuneleri çalıştırmadan önce alev iyonizasyon dedektörünün stabilize olmasını bekleyin. Kararlı olduğunda, fiberi temizlemek için yazılım başlatma yöntemini çalıştırın.
7. Kafa boşluğu gaz kromatografisi kullanılarak numune ölçümleri
- Başlatma yöntemi tamamlandıktan sonra, örnek listesindeki örnek başına 1 yeni satır oluşturun. Analiz yazılımındaki yöntemler menüsünden, 436 Current spme ethanol 2013 3dk absorbe 2_5min rg çalıştırın. Numune listesindeki her numune için METH.
- Hava, su, 5 M NaCl/proteaz kokteyl boşluklarından başlayarak numune listesini doldurun. Ardından standartları 0,3125 ila 40 mM arasında sırayla girin. İkinci tur hava, su ve 5 M NaCl/proteaz kokteyl boşlukları ile standartları takip edin.
- Test edilecek tüm homojenize embriyo süpernatan numunelerini, en düşükten en yüksek tahmin edilen etanol konsantrasyonuna kadar girin. Hava, su ve 5 M NaCl/proteaz kokteyl boşluklarının üçüncü ve son turuna girerek bitirin.
- Gaz kromatograf şişelerini, numunelerin girilme sırasına göre otomatik numune alma cihazına ekleyin. Numunelerin 10-15 dakika ısınmasına izin verin. Yazılımda örnek çalıştırmaları başlatın.
- Tüm numuneler ve son boşluklar çalıştırıldıktan sonra, numune listesine son bir numune ekleyerek ve bekleme modunda çalıştırarak yazılımda kapatma yöntemini etkinleştirin. METH. Örnek çalıştırmaları sırasında elde edilen tüm verileri yedekleyin. Ekipmanı aşağıdaki sırayla kapatın: otomatik numune alma cihazı ısıtıcısı, hidrojen tankı ve ancak kromatograf sıcaklığı 30 °C'ye ulaştıktan sonra hava tankı. Balmumu sütununu korumak için helyum tankını açık bırakın.
8. Numune etanol tepe entegrasyonu ve numune konsantrasyonu analizi
>NOT: 8.3'ten itibaren tüm değerler, tüm denklemlerin önceden doldurulduğu bir excel dosyasında hesaplanmıştır.
- Kapatma yöntemi tamamlandıktan sonra, Kromatogramı aç'a tıklayın. Sonuçları içeren klasörü açın. Örnekler bu programa otomatik olarak entegre edilir.
- Sonuçlarda, doğru tepe noktalarının entegre edildiğinden emin olun (2 ile 2,5 arasındaki etanol tepe noktaları). Tüm numuneler onaylandıktan sonra sonuçları yazdırın veya dışa aktarın.
- Etanol standartlarının tepe yüksekliğini bir grafik üzerinde çizin. Etanol standartları için eğim, Y kesişim noktası veR2 değerlerini hesaplayın (R2 >0.99 olmalıdır).
not: Bu değerler, numune tepe yüksekliğinden etanol konsantrasyonunu belirlemek için kullanılacaktır.
- Her numune için, numunenin tepe yüksekliğini etanol standartlarının Y kesişim noktasından çıkarın. GC şişelerindeki her numune için etanol değerini elde etmek için bu değeri etanol standartlarının eğimine bölün.
- Embriyolardaki etanol konsantrasyonunu hesaplamak için önce her numune için seyreltme faktörünü hesaplayın. Bu protokolün 1.3 adımında hesaplanan hacim ölçüsünü alın ve bunu hacim ölçüsü artı 500 μL'ye bölün. Bu, embriyo işleme sırasında her numuneye eklenen 5 M NaCl/proteaz kokteyl çözeltisini temsil eder (adım 4.3 ve 4.4).
- Bu numune seyreltme faktörünü kullanarak, her numune için numune etanol değeri ile çarpın. Sonuçlar mM konsantrasyonunda olacaktır. Ortam etanol değerini 10.
seyreltme faktörü ile çarparak ortam referans örneklerini hesaplayın
