1. Tamponların ve çözeltilerin hazırlanması
>NOT: Protokolde kullanılan tüm arabellekler ve çözeltiler Tablo 1'de özetlenmiştir. Verilen tampon hacimleri 10 numune hazırlamak ve çalıştırmak için yeterlidir. Tüm tamponlar +4 °C'de bir yıla kadar saklanabilir.
- Damıtılmış suda (dH2O) 1.5 M aminokaproik asit, 150 mM Bis-tris içeren 20 mL 3x jel tamponu hazırlayın. PH'ı 7.0'a ayarlayın.
- dH2O içinde 10 mL 2 M aminokaproik asit hazırlayın.
- Aşağıdakileri birleştirerek 1 mL mitokondriyal tampon hazırlayın: 0.5 mL 3x jel tamponu, 0.5 mL 2 M aminokaproik asit ve 4 μL 500 mM EDTA.
- dH2O'da 15 mM Bis-tris ve 50 mM trisin içeren 1.000 mL katot tamponu hazırlayın. PH'ı 7.0'a ayarlayın.
- 200 mL katot tamponuna 0.04 g Coomassie blue G-250 ekleyerek 200 mL mavi katot tamponu hazırlayın.
- dH2O'da 50 mM Bis-tris içeren 1.000 mL anot tamponu hazırlayın ve pH'ı 7.0'a ayarlayın.
- dH2O'da 750 mM aminokaproik asit ve% 5 Coomassie mavisi G-250 içeren 2,5 mL numune tamponu hazırlayın.
>2. Mitokondriyal lizatların hazırlanması
- Hücreleri toplamadan bir gün önce plakalayın. HEK293 veya 143B hücreleri için,% 10 fetal sığır serumu,% 1 L-glutamin,% 100 mg / mL penisilin ve 100 mg / mL streptomisin içeren Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's besiyerini (DMEM) kullanın. Hücreleri, %5 CO2 nemlendirilmiş atmosferde +37 °C'de bir hücre kültürü inkübatöründe büyütün. Toplama gününde her numune için en az 500.000 hücre olduğundan emin olun.
- Hücreleri buz gibi soğuk PBS ile bir kez nazikçe yıkayın. Hücreleri plakadan ayırmaktan kaçının. Hücreleri kazıyın ve +4 °C'de 10 dakika boyunca 800 x g'da pellet haline getirin.
- Hücre peletini buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın ve adım 2.2'deki gibi santrifüjleyin. Ticari bir kit kullanarak Bradford yöntemi ile protein konsantrasyonunu ölçün. Hücreleri +4 °C'de 10 dakika boyunca 800 x g'da peletleyin.
not: Hücre toplama işleminden sonra tüm adımları +4 °C'de gerçekleştirin ve girdap yapmayın.
- 20 mL PBS'ye 200 μL 100x proteaz inhibitörü ekleyerek proteaz inhibitörü ile 20 mL PBS hazırlayın. Buz üzerinde tutun. Proteaz inhibitörü ile PBS'deki hücreleri 5 mg / mL'lik bir nihai protein konsantrasyonuna yeniden süspanse edin.
- Hücreleri 5 mg / mL'de yeniden süspanse etmek için gereken proteaz inhibitörü ile PBS hacmini hesaplamak için, her numunedeki protein miktarını hesaplayın. Bu hesaplama için, adım 2.3'te ölçülen protein konsantrasyonunu ve adım 2.3'te yıkadıktan sonra hücreleri yeniden süspanse etmek için kullanılan PBS hacmini kullanın.
- Proteaz inhibitörü ile PBS'de 1 mL 3.3 mM digitonin hazırlayın. 1.65 mM'lik bir nihai konsantrasyona 3.3 mM digitonin ekleyin. İyice karıştırın ve 5 dakika buz üzerinde inkübe edin.
- Proteaz inhibitörü ile PBS'de 1 mL 3.3 mM digitonin hazırlamak için, 4 mg digitonini 1 mL PBS'de 100 ° C'de çökelti görünmeyene kadar çözün ve hemen buz üzerinde soğutun. 1 mL digitonin çözeltisine 10 μL 100x proteaz inhibitörü ekleyin.
not: Yalnızca yeni bir digitonin.
solüsyonu kullanın
Dikkat: Digitonin zehirlidir! Yüz maskesi, eldiven ve laboratuvar önlüğü kullanın.
- Proteinaz inhibitörü (adım 2.4'te hazırlanan) ile PBS'yi 1.5 mL'lik son hacme ekleyin. +4 °C'de 10 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın. Bu adımda mitokondri peletlenir.
- Mitokondriyal peleti mitokondriyal tamponda yeniden süspanse edin. Mitokondriyal tamponun hacmi, adım 2.4'teki PBS hacminin yarısı kadardır.
- Proteaz inhibitörü içeren PBS'de taze% 10 lauril maltosid hazırlayın (adım 2.4'te hazırlanmıştır). 10 numune için 1 mL yeterlidir. % 1'lik son konsantrasyona% 10 lauril maltoside ekleyin. Buz üzerinde 15 dakika inkübe edin (bu adım birkaç saate kadar daha uzun olabilir).
- +4 °C'de 20 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı yeni bir tüpe toplayın. Protein konsantrasyonunu bir kit kullanarak Bradford yöntemiyle ölçün. Adım 2.8'de kullanılan lauril maltosid hacminin yarısı kadar bir hacim olan numune tamponu ekleyin. Numuneler -80 °C'de 6 aya kadar saklanabilir.
3. BN-PAGE için gradyan jelin hazırlanması
- BN-PAGE için gradyan jeli oda sıcaklığında dökün. Degrade yapıcıyı bir karıştırma plakasına yerleştirin ve esnek boru ile peristaltik pompaya bağlayın. İğne ile bir infüzyon setini boruya takın. Degrade yapıcının proksimal odasına manyetik bir karıştırıcı yerleştirin. Hortumu dH2O ile maksimum pompa hızında 10 dakika yıkayın.
- Boruyu ve degrade oluşturucuyu boşaltın. Degrade oluşturucunun odaları arasındaki kanalda kalan dH2O'yu çıkarmak için bir pipet kullanın. Kanalı ve boruyu valf ile kapatın.
- Döküm çerçeve ve kelepçeler kullanarak, altta bir delik bulunan tutucuya iki cam plaka monte edin ve standın üzerine yerleştirin. Su dengesi olan düz bir yüzeyde az ya da çok olduğundan emin olun. Boruya bağlı iğneyi cam plakalar arasına yerleştirin.
- % 6 ve% 15 jel çözeltileri hazırlayın (Tablo 2). Buz üzerinde tutun. En son amonyum persülfat (APS) ve tetrametilendiamin (TEMED) ekleyin (polimerizasyona başlarlar). Hava kabarcıkları oluşmasını önlemek için hafifçe karıştırın.
- Degrade jel-karıştırıcı boru haznesinin proksimal ucunu %6 jel ve distal ucunu %15 jel ile yükleyin. Jelin toplam hacmi, cam plakalar arasındaki ayırma jelinin hacmine eşit olmalıdır. Bu nedenle, 8,3 cm x 7,3 cm boyutunda bir jel için gradyan jel karıştırıcıya 2,6 mL %6 jel ve 2,1 mL %15 jel kullanın.
- Manyetik karıştırıcıyı açın ve degrade yapıcının odaları arasındaki boruyu ve kanalı açın. Peristaltik pompayı hemen 5 mL/dk'ya getirin. Cam plakaları doldurun ve kabarcıkların jele girmesine izin vermeyin. Boruda jel olmadığında iğneyi çıkarın.
- Jeli nazikçe dH2O ile kaplayın ve polimerizasyon için jeli en az 1 saat oda sıcaklığında tutun.
- Jeli döktükten hemen sonra, gradyan odalarını dH2O ile doldurarak ve peristaltik pompayı maksimum hızda kullanarak hortumu yıkayın. İki ve daha fazla jel hazırlarken, sistemi her zaman arada temizleyin.
- 3 mL 3x jel tamponu karıştırarak 1x jel tamponu hazırlayın ve 6 mL dH2O ekleyin. dH2O'yu jelin yüzeyinden filtre kağıdı ile nazikçe çıkarın. Jelin yüzeyini 1x jel tamponu ile yıkayın. 1x jel tamponunu filtre kağıdı ile nazikçe çıkarın.
- Jel üzerindeki filtre kağıdından liflerden kaçının. Bunu sağlamak için kağıdı makasla küçük parçalara ayırın, ancak kağıdı yırtmayın.
- Tarağı cam plakaların arasına yerleştirin, ancak istifleme jelini tarağın altına dökebilmek için tamamen batırmayın. %4'lük istifleme jelini hazırlayın (Tablo 2). Kolayca polimerizasyona başladıkları için APS ve TEMED'i en son ekleyin. Hava kabarcıklarından kaçınarak nazikçe karıştırın.
- İstifleme jelini kaplayın, tarağın altındaki kabarcıkları önleyin ve tarağı tamamen daldırın. İstifleme jelinin en az 30 dakika polimerize olmasına izin verin. Tarağı çıkarın ve kuyuları bir pipet kullanarak 1x jel tamponu ile yıkayın.
- Polimerizasyondan sonra jel +4 °C'de birkaç gün saklanabilir. Jeli saklamak için, jelin kurumasını önlemek için jeli dH2Ove plastik film ile ıslatılmış kağıda sarın.
4. Mavi doğal jel elektroforezi
NOT: OXPHOS komplekslerinin bozulmasını önlemek için elektroforezi +4 °C'de çalıştırın. Önceden soğutulmuş tamponlar kullanın.
- Jel kasetini mavi katot tamponu ile kuyucukların dibine kadar yükleyin. Kaset üste kadar doldurulmadığında numunelerin yüklenmesi daha kolaydır. Kuyuları mavi katot tamponu ile yıkayın ve ardından kuyuları pipet kullanarak mavi katot tamponu ile doldurun.
- Numuneleri (5-30 μg protein) kuyucuklara yükleyin. Jel kasetini mavi katot tamponu ve anot tamponu ile tankı yavaşça üstüne kadar doldurun.
- Jeli 40 V'luk sabit bir voltajda 15 dakika çalıştırın. Ardından voltajı 80 V'a yükseltin (veya 6 mA'lık sabit bir akım kullanın), 10 mA'yı aşmayın. Boya jel uzunluğunun 2 / 3'üne ulaşana kadar jeli çalıştırın.
- Mavi katot tamponunu katot tamponu ile değiştirin ve boya cephesi bitene kadar elektroforeze devam edin. Toplamda, elektroforez yaklaşık 3 saat sürer.
- Cam plakaları alın ve proteinleri yarı kuru lekeleme ile poliviniliden florür (PVDF) membranına aktarın.