Yöntem makalesi

Fare Daimi Orta Serebral Arter ligasyon Of Uygulama

DOI:

10.3791/3039

⸱

25 Temmuz 2011

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Physiology, University of Rochester, 2Department of Neurology, University of Alabama at Birmingham, 3Departments of Anesthesiology, Pharmacology and Physiology, University of Rochester

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Orta serebral arter (MCA) ligasyonu, hayvan modellerinde fokal serebral iskemi çalışma bir tekniktir. Bu yöntemde, orta serebral arter kraniotomi maruz kalmaktadır ve koterizasyon tarafından bağlandı. Bu yöntem son derece tekrarlanabilir infarkt hacimleri ve mevcut diğer yöntemlere göre artış post-operatif sağkalım oranları verir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fokal serebral iskemi, inme hastalarında görülen en yaygın türü arasında yer alıyor. Klinik önemi nedeniyle İskemiden sırasında ortaya çıkan olaylardan çalışmak için uygun hayvan modelleri geliştirmek için uzun bir çaba olmuştur. Bu tekniklerin en yaygın olan kemirgenler, birçok farklı hayvan modelleri kullanarak, geçici veya kalıcı fokal veya global iskemi modelleri içermektedir.

Kemirgenler 1-6 fokal iskemi modeli olarak da literatürde pMCAo denir kalıcı MCA ligasyonu yöntemi yaygın olarak kullanılır. Bu yöntem başlangıçta Tamura ve arkadaşları tarafından sıçanlarda için tarif edilmiştir. 1981 7. Bu protokol bir kraniotomi MCA ve proksimal bölgelerde elektrokoagülasyon tıkalı erişmek için kullanılır oldu. Infarktlar oklüzyonu konuma bağlı olarak çoğunlukla kortikal ve bazen striatal bölgeleri içerir. Bu teknik, şimdi iyi kurulmuş ve birçok laboratuvarda 8-13 kullanılmaktadır. Erken bu tekniğin kullanımı "infarkt çekirdek" ve "penumbra" 14-16 tanımı ve açıklaması yol açtı, ve genellikle, potansiyeli nöroprotektif bileşikler 10, 12, 13, 17 değerlendirmek için kullanılır . Sıçanlarda yapılan ilk çalışmalar olmasına rağmen, kalıcı MCA ligasyonu küçük modifikasyonlar 18-20 farelerde başarıyla kullanılmaktadır.

Bu model, tekrarlanabilir infarktlar ve artan sonrası sağ kalım oranları elde edilir. Iskemik inme insanlarda yaklaşık% 80 MCA alan 21 olur ve böylece bu vuruş çalışmaları için bir çok ilgili bir model . Şu anda, orada inmeli hastalarda etkili tedaviler oldukça kıt ve böylece potansiyel farmakolojik bileşikler test ve fizyolojik sonuçlarını değerlendirmek için iyi bir model için bir ihtiyaç vardır. Bu yöntem ayrıca, in vivo hücre içi hipoksi yanıt mekanizmaları eğitim için kullanılabilir .

Burada, bir C57/BL6 fare MCA ligasyonu cerrahi sunuyoruz. Biz ameliyat öncesi hazırlık, MCA ligasyonu cerrahi ve infarkt hacimleri ölçümü için 2,3,5 triphenyltetrazolium klorür (TTC) ile boyanarak açıklar.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Rochester komitesinin araştırma hayvanların etik (UÇAR) ayrılmış Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Aseptik teknikler protokol sırasında takip edilmelidir. Steril eldiven ve maske kullanılması gereklidir.

Protokol sırasında kullanılan ekipman, malzeme, kimyasallar, araçlar, Tablo 1'de açıklanmıştır.

1. Pre-cerrahi Hazırlık

  1. Hemen ameliyat sonrası ve ardından ilk 24 saat post-operatif dönem boyunca her 3-5 saat, 2 saat önce cerrahi buprenorfin (0.05mg/kg) subkutan farelere enjekte.
  2. Tüm cerrahi aletler, gazlı bez sünger, pamuk uçlu aplikatörler otoklav ile sterilize edin. Cerrahi aletler, sağ kullanmadan önce kuru steril gazlı bez cerrahisi ve hava içinde% 70 etanol içinde tutun. % 70 etanol ile çalışma alanı püskürtün.
  3. % 3 isofluorane-% 20 oksijen gaz karışımı ile bir anestezik vaporizatör kullanarak fare anestezisi. Debimetre ile oksijen miktarını ayarlayın. Parmak veya kuyruk pinching (tepkisiz) tarafından anestezi seviyesini test edin. % 2 (v / v) isofluorane ile anestezi seviyesini korumak.
  4. Farenin gözleri suni gözyaşları uygulayın ve cerrahi işlem sırasında gözün zarar görmesini önlemek için dikkatli kullanın. Lateral pozisyonda sağ tarafta fare yerleştirin.
  5. Tıraş, sol göz ve sol kulak hayvan kesme makineleri kullanarak taban arasındaki sol tarafındaki alanda. Betadin çözüm ve pamuk uçlu aplikatörler alan ve hafifçe ovuşturarak kullanarak% 70 etanol arasında değişen alan temizleyin. Gerektiği kadar tekrarlayın.
  6. 37 vücut ısısını korumak için bir rektal prob bağlı bir ısıtma yastığı ° C üzerinde fare yerleştirin. Mineral yağ kullanarak rektal prob yerleştirin.
  7. Mikroskop altında sağ tarafta fare konumunu ve bant ile sabitleyin. Bir gazlı bez sünger bir pencere kesin ve cerrahi alanı kapsayacak.

2. Cerrahi Prosedür ve MCA ligasyon

  1. Sol göz ve ince düz makas kullanılarak sol kulak tabanı arasındaki dikey bir kesi olun. Kavisli hemostat cerrahi alanında açık tutmak için kullanın.
  2. Yaylı makas kullanılarak temporal kas yatay bir kesi yapmak ve biraz forseps ile yavaşça çekerek kafatası temporal kas ayrı.
  3. Kavisli bir forseps ile çene kemiği tutarak bir 18G iğne kullanarak zigomatik ark ve squamosal kemiğin birleştiği küçük bir subtemporal kraniyotomi olun.
  4. MCA ile kafatası kemik rongeurs küçük parçalara kaldırarak Açığa. Zigomatik ark ve orbital içeriği bu işlem sırasında hasar olmamalıdır. Bu işlem sırasında doku aşırı kuruma oluşursa, pamuk uçlu aplikatörler ile steril PBS geçerlidir.
  5. Küçük damar cauterizer kullanarak MCA distal kısmının Arter.
  6. Temporal kas orijinal konumuna geri koyun ve 5-0 naylon sütür cerrahi kesi sitenizi kapatın.
  7. Anestezi durdurun ve rektal prob kaldırmak. 2. doz subkutan buprenorfin (0.05mg/kg) bir fare enjekte edilir. Bir ısıtma paneli ile 37 ° C tutuldu kafesine fare dön.
  8. Sonraki 24 saat süreyle herhangi bir rahatsızlık (iştah azalması / su tüketimi, hunched duruş, artan solunum, saç Pilo-dikilen) için fare yakından izlemek. 24 saat için buprenorfin subkutan her 3-5 saatlik bir ameliyat sonrası fare enjekte edilir. Bu dönemde kurtarma jel ile fare sağlayın.

3. TTC Boyama ve İnme Hacminin Belirlenmesi

  1. Ameliyat sonrası yirmi dört saat derin fare uyutmak transcardially fosfat% 4 TTC (w / v) kullanarak 15 dakika sonra 10 dakika için% 4 paraformaldehid çözüm için tamponlu salin (PBS) ile fare serpmek orta akış hızında mini peristaltik pompa. Beyin çıkarın ve bir gecede% 4 paraformaldehid çözüm içine yerleştirin.
  2. Beyin kesit bloğu içine yerleştirin. Beyin tıraş bıçakları kullanarak 1mm kalınlığında dilimler halinde dilimleyin.
  3. Milimetrenin ölçekli cetvel yanında dilimleri yerleştirin. Diseksiyon mikroskobu bağlı bir dijital kamera kullanarak dilimleri Fotoğraf.
  4. Görüntü J Yazılım (http://rsbweb.nih.gov/ij/) kullanarak karşı sitenin toplam alanı ipsilateral sitesi olmayan enfarkte alan çıkarılarak vuruş alanını hesaplayınız. Atım hacmi dilimleri 22 kontur istifleme alanı hesaplayın.

4. Yol Görüntü J yazılım kullanımı

  1. Dosya menüsünde tıklayarak Görüntü J yazılım analiz edilecek görüntü dosyasını açın.
  2. Programında 'düz çizgi' sekmesini tıklayın. Cetvel üzerinde iki kenar boşlukları arasındaki düz bir çizgi çizin. 'Analiz' menüsünü tıklayın ve 'set ölçekli' seçeneğini seçin. 1 olarak bilinen mesafe, mm gibi uzunluk birimi ayarlayın.
  3. 'Freehand daire' sekmesini tıklayın. Kontralateral yarımkürede anahat bir daire çizin. 'Analiz' menüsünü tıklayın ve 'tedbir' seçeneğini seçin. Çizilen dairenin alanı gösteren hesaplama penceresi açılır.
  4. Ipsilateral hemisferde hariç inme (beyaz) alanı çevresinde başka bir daire çizin. Adım 4.3 'te belirtilen bölge ölçün. Yeni değeri hesaplama penceresine eklenecektir. 1. ve 2. değerler arasındaki fark, aşağıdaki formül olarak gösterilir infarkt alanında temsil eder.
  5. Adımları 4.2-4.4 tekrarlayarak her dilim vuruş alanını hesaplayınız. (ΣA n) her dilim hesaplanan inme alanının toplamı alın. Bu her dilim kalınlığı 1mm olduğu gerçeğini bilerek atım hacmi temsil eder.
    ΣA n x 1mm (her dilim kalınlığı) = Strok hacmi

5. Temsilcisi Sonuçlar:

Fare kalıcı MCA ligasyonu ile elde infarktlar genellikle kortikal. Ancak, MCA lentikülostriat dal proksimalinde bağlandı ise subkortikal lezyonlar elde etmek mümkündür. MCA ligasyonu sonrası felç hacimleri, 10mm ³, 35mm ³ 19, 23 değişebilir. Inme hacimleri ise 23 20mm, 35mm ³ ³ arasında Filiano ark MRI görüntülerinden tespit Moyanova ark TTC boyama ile hesaplanan atım hacimlerine 19, 10mm, 22mm ³ ³ arasında. Belki ligasyon tam yerini ve inme hacimlerini ölçmek için kullanılan farklı yöntemler bu farklılıkların olası nedeni.

Şekil 1, vahşi tip C57/BL6 fare TTC boyanmış beyin 24 saat yazılan kalıcı MCA ligasyonu gösterilmiştir. İnme sitesi görünümü (Şekil 1A, B) beyaz. Şekil 1A ve B farklı açılardan infarkt sitesi göstermektedir. Şekil 2 (Şekil 2A-G) posterior anterior gelen TTC lekeli inme beynin 1mm kalınlığında dilimler gösterir. 24 saat ameliyat sonrası infarkt hacmi hesaplandı. Infarkt hacmi ~ 23mm ³.

figure-protocol-1
Şekil 1. İnme sitesi. AB Temsilciliği, TTC MCA ligasyonu sonrası tüm beyin görüntüleri, 24 saat boyandı. Beyaz alan infarkt temsil eder.

figure-protocol-2
Şekil 2. Temsilcisi sonuçları (A> G), TTC lekeli 1mm beyin bölümleri, 24 saat sonra MCAL. Dilimler posterior anterior hizalanır. Beyaz alan infarkt temsil eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kalıcı MCA ligasyonu yöntemi yüksek tekrarlanabilir infarkt hacmi ve mevcut diğer yöntemlere göre artış post-operatif sağkalım oranları verir. Prosedürün kolay ve kısa bir süre (~ 30 dakika) daha pratik hale getirir. Bu yöntem yaygın olarak, hem de fare ve sıçanlar kullanılır.

Bu teknik bir stereomikroskop altında bir invaziv cerrahi gerektirir. Bu nedenle, bir mikroskop altında faaliyet gösteren ve başarılı bir kraniotomi mükemmelleştirmek tecrübesi çok önemlidir. Laboratuarda deneyler önce...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cerrahi teknik, başlangıçta, Medical College of Georgia Dr William D. Hill laboratuvarda elde edildi. Yazarlar ayrıca, Dr. David A. Rempe ve Landa Prifti diseksiyon kamera kullanımı için teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma Ulusal Sağlık Enstitüsü, NS041744, NS051279, F31 NS064700 ve AHA 30815697D tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
ADI FİRMA VE KATALOG NUMARASI
A. Çözümleri ve Kimyasallar
Povidon-İyot Çözüm, Cerrahi Scrub Aplicare, 82-209
% 70 Etanol Koptec, V1001
2,3,5 triphenyltetrazolium klorür (TTC) Sigma, T8877
4% Paraformaldehit Elektron Mikroskopi Bilimler, 159SP
7.4: Fosfat Tuzlu, pH Tamponlu Üretilen ve laboratuvar sterilize.
Madeni Yağ PML Microbiologicals, R6570
Isofluorane Butler Şirket, 029.405
Buprenorfin (0.3mg/ml) Hospira, NDC 0409-2012-32
Suni gözyaşları Butler Şirket, 007.312
Canlandırıcı Jel Clear H 2 O, 72-01-5022
B. Cerrahi Malzemeleri ve Ekipmanları
C57/BL6 fare, 10-12 haftalık Koloni üniversite vivaryum yetiştirilen
% 100 oksijen deposu Airgas
Anestezik Buharlaştırıcı ve Akış metre Surgivet, Model 100
Rektal Probe Isıtma Pedi Güzel Bilim Araçları, TR200
Diseksiyon mikroskobu Zeiss, STEMI 2000
Isıtma paneli Petco Hizmetleri Ltd 0307-013
Küçük Gemi Cauterizer Seti Güzel Bilim Araçları, 18.000-00
Mini Peristaltik Pompa Harvard Apparatus, MPII
1 ml şırınga BD, 329.650
18G iğne Becton Dickinson, 305.196
Cerrahi 5.0 Naylon Sütür Ethilon, 698H
Blok Kesit Kent Bilimsel, 1mm
Tek Kenar Razor Blades Elektron Mikroskopi Bilimler, 71.962
Etiket Şeridini Scienceware, Bel-sanat Ürünler F13463-2075
Tül Süngerler Kendall curity 2252, Johnson ve Johnson 6415
Pamuk İpucu Aplikatörler Püriten 806-WCL
C. Cerrahi Aletler
Cerrahi Bahar Makas Güzel Bilim Araçları 15.003-08
Microdissecting forseps açılı Güzel Bilim Araçları 5 / 45
Microdissecting forseps kavisli Güzel Bilim Araçlar 5 Ti
İnce düz makas Güzel Bilim Araçları 14.568-12
Eğimli kemik rongeur Güzel Bilim Araçları 16.021-14
Hartman Hemostat Eğri Güzel Bilim Araçları 13.003-10

Tablo 1: MCA ligasyonu işlemi için kullanılan malzemeler, araç ve kimyasalların listesi. A. Çözümleri ve Kimyasallar, B. Cerrahi Malzemeleri ve Ekipmanları, C. Cerrahi Aletler.

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Britton, M., Rafols, J., Alousi, S., Dunbar, J. C. The effects of middle cerebral artery occlusion on central nervous system apoptotic events in normal and diabetic rats. Int J Exp Diabesity Res. 4, 13-20 (2003).
  2. Ciceri, P., Rabuffetti, M., Monopoli, A., Nicosia, S. Production of leukotrienes in a model of focal cerebral ischaemia in the rat. Br J Pharmacol. 133, 1323-1329 (2001).
  3. Jin, K. Delayed transplantation of human neural precursor cells improves outcome from focal cerebral ischemia in aged rats. Aging Cell. 9, 1076-1083 (2010).
  4. McCaig, D. Evolution of GADD34 expression after focal cerebral ischaemia. Brain Res. 1034, 51-61 (2005).
  5. Shirotani, T., Shima, K., Chigasaki, H. In vivo studies of extracellular metabolites in the striatum after distal middle cerebral artery occlusion in stroke-prone spontaneously hypertensive rats. Stroke. 26, 878-884 (1995).
  6. Wu, Y. P., Tan, C. K., Ling, E. A. Expression of Fos-like immunoreactivity in the brain and spinal cord of rats following middle cerebral artery occlusion. Exp Brain Res. 115, 129-136 (1997).
  7. Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J Cereb Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1981).
  8. Bederson, J. B. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke. 17, 472-476 (1986).
  9. Carswell, H. V. Genetic and gender influences on sensitivity to focal cerebral ischemia in the stroke-prone spontaneously hypertensive rat. Hypertension. 33, 681-685 (1999).
  10. Mary, V., Wahl, F., Uzan, A., Stutzmann, J. M. Enoxaparin in experimental stroke: neuroprotection and therapeutic window of opportunity. Stroke. 32, 993-999 (2001).
  11. Menzies, S. A., Hoff, J. T., Betz, A. L. Middle cerebral artery occlusion in rats: a neurological and pathological evaluation of a reproducible model. Neurosurgery. 31, 100-107 (1992).
  12. Iaci, J. F. Glial growth factor 2 promotes functional recovery with treatment initiated up to 7 days after permanent focal ischemic stroke. Neuropharmacology. 59, 640-649 (2010).
  13. Richard, M. J. P., Khan, B. V. C. B. J., Saleh, T. M. Cellular mechanisms by which lipoic acid confers protection during the early stages of cerebral ischemia: A possible role for calcium. Neuroscience Research. , (2011).
  14. Heiss, W. D. Progressive derangement of periinfarct viable tissue in ischemic stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 12, 193-203 (1992).
  15. Nedergaard, M., Gjedde, A., Diemer, N. H. Focal ischemia of the rat brain: autoradiographic determination of cerebral glucose utilization, glucose content, and blood flow. J Cereb Blood Flow Metab. 6, 414-424 (1986).
  16. Nowicki, J. P., Assumel-Lurdin, C., Duverger, D., MacKenzie, E. T. Temporal evolution of regional energy metabolism following focal cerebral ischemia in the rat. J Cereb Blood Flow Metab. 8, 462-473 (1988).
  17. Butcher, S. P., Bullock, R., Graham, D. I., McCulloch, J. Correlation between amino acid release and neuropathologic outcome in rat brain following middle cerebral artery occlusion. Stroke. 21, 1727-1733 (1990).
  18. Arlicot, N. Detection and quantification of remote microglial activation in rodent models of focal ischaemia using the TSPO radioligand CLINDE. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 37, 2371-2380 (2010).
  19. Moyanova, S. G. Protective role for type 4 metabotropic glutamate receptors against ischemic brain damage. J Cereb Blood Flow Metab. , (2010).
  20. Ortolano, F. Advances in imaging of new targets for pharmacological intervention in stroke: real-time tracking of T-cells in the ischaemic brain. Br J Pharmacol. 159, 808-811 (2010).
  21. O'Neill, M. J., A, C. J. Rodent models of focal cerebral ischemia. Current Protocols in Neuroscience. , 9.6.1-9.6.32 (2000).
  22. Lin, T. N., He, Y. Y., Wu, G., Khan, M., Hsu, C. Y. Effect of brain edema on infarct volume in a focal cerebral ischemia model in rats. Stroke. 24, 117-121 (1993).
  23. Filiano, A. J., Tucholski, J., Dolan, P. J., Colak, G., Johnson, G. V. Transglutaminase 2 protects against ischemic stroke. Neurobiol Dis. 39, 334-343 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kal c MCA LigasyonuFokal Serebral skemiFare nme ModeliKraniyotomi Prosed rDamar KoterizasyonuTTC BoyamaEnfarkt Hacmi KantifikasyonuCerrahi Haz rl kPostoperatif zleme

İlgili makaleler