Multianalit İmmünoboncuk Testi: İnsan Serum Numunesinde Çoklu Antikor Alt Tiplerinin Eşzamanlı Tespiti için Akış Tabanlı Bir İmmünoassay Tekniği

Özet

Kaynak: Fhied, CL ve diğerleri, Covid-19 için Multianalit İmmünoboncuk Testi Kullanılarak Serokonversiyonun Dinamik İzlenmesi. J. Vis. Uzm. (2022).

Bu videoda, bir serum örneğindeki çeşitli antikor izotiplerini aynı anda tespit etmek için farklı antijenlerle birleştirilmiş floresan manyetik boncuklar veya mikroküreler kullanan bir immünolojik test tekniği açıklanmaktadır. Test, bir enfeksiyon sırasında veya aşılama sonrası serokonversiyonun anlaşılmasında yardımcı olur.

Protokol

İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Antijenle konjuge mikrokürelerin hazırlanması

1. Benzersiz boncuk bölgelerine sahip üç farklı manyetik mikro küre şişesi seçin, kullanılan her şişe için boncuk kimliğini ve lot bilgilerini kaydedin.
   not: Her bir farklı mikroküre bölgesi için aşağıdaki adımlar izlenecektir. Mikro küreler ışığa duyarlıdır ve uzun süre ışığa maruz kalmaktan korunmalıdır. Yıkama adımları sırasında mikro kürecikleri rahatsız etmemeye dikkat edin. Rahatsız edilirse, ikinci bir 60 saniye ayırmaya izin verin.
2. Mikroküre stoğunu 60 saniye boyunca vorteksleyin ve toplanmış boncukları ayırmak için kullanmadan önce 5 dakika boyunca sonikasyon yapın.
3. 1.0 x 10⁶ boncuğu 1.5 mL düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
4. Tüpü manyetik bir ayırıcıya yerleştirin ve 60 saniye boyunca ayrılmanın gerçekleşmesine izin verin. Tüp hala manyetik ayırıcının içindeyken, boncuk peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın.
5. Tüpü manyetik ayırıcıdan çıkarın, boncukları 100 μL HPLC sınıfı su ile yeniden süspanse edin ve 30 saniye boyunca girdaplayın. Tüpü 60 saniye boyunca manyetik ayırıcıya geri yerleştirin ve ardından süpernatanı çıkarın. Bu yıkama protokolünü iki kez tekrarlayın.
6. Tüpü manyetik ayırıcıdan çıkarın ve yıkanmış mikroküreleri 90 μL 100 mM Monobazik Sodyum Fosfat, pH 6.2 (Aktivasyon Tamponu) içinde 30 saniye boyunca girdap ile yeniden süspanse edin.
7. Mikrokürelere 10 μL 50 mg / mL Sulfo-NHS (Aktivasyon Tamponu ile seyreltilmiş) ekleyin ve 10 saniye boyunca hafifçe girdaplayın. 10 μL 50 mg / mL EDC çözeltisi (Aktivasyon Tamponu ile seyreltilmiş) ekleyin ve 10 saniye boyunca hafifçe girdap yapın. Mikroküreleri oda sıcaklığında (RT) her 10 dakikada bir hafif bir girdapla 20 dakika inkübe edin.
8. Toplam iki yıkama için LC/MS sınıfı su yerine 50 mM MES, pH 5.0 (Birleştirme Tamponu) ile 1.4-1.5 yıkama adımlarını tekrarlayın.
9. Tüpü manyetik ayırıcıdan çıkarın ve boncukları 100 μL Birleştirme Tamponu ile 30 saniye boyunca girdap ile yeniden süspanse edin ve hemen ardından istenen miktarda protein ekleyin.
10. Kaplin Tamponu ile toplam hacmi 150 μL'ye getirin. Birleştirme reaksiyonunu girdap ile 30 saniye karıştırın ve RT.
    'da döndürerek 2 saat inkübe edin not: Burada tanımlanan tahliller için, konjugasyonlar aşağıdaki protein konsantrasyonları ile gerçekleştirildi: Spike S1: 5 μg; Nükleokapsid: 5 μg; Zar: 12,5 μg.
11. Toplam iki yıkama için LC / MS dereceli su yerine Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)-1% Keçi Serumu Albümini,% 0.01 Polisorbat-20 (Söndürme Tamponu) ile yıkama adımı 1.4'ü tekrarlayın. Yıkanmış mikroküreleri, 30 s.
    için girdap ile% 0.05 sodyum azid içeren 100 μL Söndürme Tamponu içinde yeniden süspanse edin not: Başka herhangi bir prosedüre geçmeden önce boncukların en az 6 saat tamamen sönmesine izin verin.
12. Otomatik bir hücre sayacı veya bir hemositometre kullanarak kurtarılan mikro kürelerin sayısını sayın. Gözlemlenen boncuk konsantrasyonunu kaydedin.
13. Birleştirilmiş mikro kürecikleri karanlıkta 4 °C'de soğutun.

2. Prosedürler

1. Test performansı (Temel protokol)
   1. Birleştirilmiş mikroküreleri 30 saniye boyunca girdapla yeniden askıya alın ve ~ 60-90 saniye boyunca sonikat yapın.
   2. Her bir boncuk kolloidinden gerekli miktarı ilgili tüpten çıkarın ve boncuk kolloidlerini yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpünde birleştirin.
   3. Tüpü manyetik bir ayırıcıya yerleştirin ve 60 saniye boyunca ayrılmanın gerçekleşmesine izin verin. Tüp hala manyetik ayırıcının içindeyken, boncuk peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın.
   4. Boncukları ayırıcıdan çıkarın, boncukları 100 μL PBS-%1 sığır serum albümini, %0.01 Polisorbat-20 (Test Tamponu) ile yeniden süspanse edin ve 30 saniye boyunca girdaplayın. Tüpü manyetik bir ayırıcıya yerleştirin ve 60 saniye boyunca ayrılmanın gerçekleşmesine izin verin. Bu yıkama protokolünü (yani adım 2.1.3-2.1.4) iki kez tekrarlayın.
   5. Her hedef için 1 μL'de 100 mikrokürelik bir nihai konsantrasyon oluşturmak için uygun hacimde Test Tamponu ekleyerek 3-plex çalışan mikroküre karışımının konsantrasyonunu ayarlayın.
   6. Adım 2.1.5'te hazırlanan mikroküre karışımının 12.5 μL'sini 384 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna veya 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 25 μL'yi alikot edin.
   7. Plazma / serum örneklerini Test Tamponunda 500 kat seyreltin. İstenen titrasyona göre standart numuneler hazırlayın.
   8. Boş numune olarak 12.5 μL Test Tamponu ekleyin ve seyreltilmiş numunenin veya standardın her birini, 384 oyuklu bir numune plakasının belirlenmiş her bir oyuğuna veya 25 μL'lik boş, seyreltilmiş numune veya standardı 96 oyuklu bir numune plakasının her bir oyuğuna ekleyin.
   9. Plakayı bir alüminyum conta veya folyo ile örtün ve 700 rpm'ye ayarlanmış bir plaka çalkalayıcı üzerinde RT'de 1 saat inkübe edin.
      not: Seyreltme eğrileri için şematik Tablo 1'de verilmiştir.
   10. Adım 2.1.11'de belirtildiği gibi Test Tamponu ile 4 μg/mL'de bir anti-insan tespit antikorları çözeltisi (ikincil antikor çözeltileri) hazırlayın.
   11. Süper Parlak 436 (SB) / Keçi anti-insan IgA, Phycoerythrin (PE) ile konjuge edilmiş Keçi-anti-insan IgM'yi hazırlayın 4 μg / mL'de konjugat tespit antikorları; veya Keçi-anti-insan IgM, SB Konjugatı / Keçi-anti-insan IgG, PE Konjuge algılama antikorları 4 μg / mL.
       not: 384 oyuklu bir plaka formatı için, hazırlanan ikincil antikor çözeltisinin 12.5 μL/oyuklu ve 96 oyuklu bir plaka formatı için 25 μL/kuyucuk gereklidir.
   12. Plakayı manyetik bir ayırıcı üzerine yerleştirin, hızlı bir şekilde yıkayın ve kuyulardan sıvıyı çıkarmak için biyolojik tehlike kabının üzerine kuvvetlice ters çevirin. Plaka hala ters çevrilmiş durumdayken, plakayı kalın bir tomar kağıda kuvvetlice vurun.
   13. Her bir kuyuyu 100 μL Tahlil Tamponu ile yıkayın ve sıvıyı, daha önce tarif edildiği gibi bir biyolojik tehlike kabı üzerinde zorla ters çevirerek çıkarın. Bu adımları (2.1.12-2.1.13) toplam iki yıkama için tekrarlayın. Kullanılmış tüm kağıt tomarlarını biyolojik tehlike kabına atın.
   14. 384 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 12.5 μL veya 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 25 μL ikincil antikor çalışma çözeltisi ekleyin. Plakayı bir alüminyum conta veya folyo ile örtün ve 700 rpm'ye ayarlanmış bir plaka çalkalayıcı üzerinde RT'de 30 dakika inkübe edin.
   15. 2.1.12-2.1.13 yıkama adımlarını tekrarlayın.
   16. 384 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 75 μL veya 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 100 μL ekleyin. Plakayı bir alüminyum conta veya folyo ile örtün ve 700 rpm'ye ayarlanmış bir plaka çalkalayıcı üzerinde RT'de 5 dakika inkübe edin.
   17. Sistem kılavuzuna göre cihaz analizörü aracılığıyla 60 μL'yi analiz edin.

Tablo 1: Standart eğriler için seyreltme serileri: IgG serotipi için standart eğriler için kullanılan seyreltme faktörleri tablosu; α-Spike S1 ve α-Nükleokapsid için 1 μg/mL'den başlayan 7 noktalı, 1:5 seri seyreltme eğrisi ve α-Membran antikorları için 5 μg/mL olarak sunulur.

Standart Numara	Seyreltme serisi	Anti-Spike S1 veya N (μg/mL)	Anti-Membran (μg/mL)
boş	boş	-	-
1	STD7 1:1	1	5
2	STD6 1:5	0,2	1
3	STD5 1:25	0,04	0,2
4	STD4 1:125	0,008	0,04
5	STD3 1:625	0,0016	0,008
6	STD2 1:3125	0.00032	0,0016
7	STD1 1:15625	0.000064	0.00032

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
384 kuyucuklu siyah yan polistiren mikrotitre plakaları	Termo Balıkçı	12-565-346
Aktivasyon tamponu (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2)	Evde hazırlandı
Test tamponu (PBS,% 1 Sığır Serum Albümini,% 0.01 Polisorbat-20)	Evde hazırlandı
Sığır Serumu Albümini, ısı şoku fraksiyonu	MilliporeSigma	A-7888-50G
Birleştirme tamponu (50 mM MES, pH 5.0)	Evde hazırlandı
COVID 19 M Koronavirüs Rekombinant Matriks Proteini (6xHistag)	Biyokaynak	MBS8574735
Tek kullanımlık pipet uçları
EDC (1-Etil-3 - [3-dimetilaminopropil] karbodiimid hidroklorür)	Termo Balıkçı	PIA35391
Keçi Albümini, Fraksiyon V Tozu	Kırlangıç Sigma	A2514-1G
IgA Keçi anti-İnsan, R-PE, Poliklon	Termo Balıkçı	OB205009
IgG Keçi anti-İnsan, R-PE, Poliklonal	Termo Balıkçı	OB204009
IgG Keçi anti-Tavşan, R-PE, Poliklonal	Termo Balıkçı	OB403009
gM Keçi anti-İnsan, R-PE, Poliklonal	Termo Balıkçı	OB202009
IgM Fare anti-İnsan, SB 436, Klon SA-DA4	Termo Balıkçı	62999842
Enstrüman Analiz Cihazı	Luminex A.Ş.	INTELLIFLEX-RUO
Düşük Bağlı mikrosantrifüj tüpleri (1,5 mL)	Termo Balıkçı	13-698-794
MagPlex-C Mikro Kürecikler, Bölge XXX	Luminex A.Ş.	MC10XXX-01
MES hidrat (2- (N-Morfolino) etan sülfonik asit hidrat)	MilliporeSigma	M2933
Mikroplaka alüminyum sızdırmazlık bandı	Termo Balıkçı	07-200-683
Polisorbat-20	Termo Balıkçı	BP337-500
Kalite Biyolojik A.Ş. PBS, PH 7.2	Termo Balıkçı	50-751-7328
Söndürme tamponu (PBS, %1 Keçi Serumu Albümini, %0.01 Polisorbat-20)	Evde hazırlandı
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nükleokapsid Proteini (Onun etiketi)	Çin Biyolojikleri	40588-V08B
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Proteini (S1 Alt Birimi, Etiketi)	Çin Biyolojikleri	40591-V08H
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD Antikoru, Tavşan pAb	Çin Biyolojikleri	40592-T62
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) nükleokapsid antikoru, tavşan mAb	Çin Biyolojikleri	40588-R0004
SARS-CoV-2 (COVID-19) Membran Antikoru (IN), Tavşan pAb	ProSci	10-516
Sülfo-NHS (N-hidroksisülfosüksinimid)	Termo Balıkçı	PIA39269
Yıkama Tamponu (PBS, %0.01 Polisorbat-20)	Evde hazırlandı
Su, LC / MS sınıfı	Termo Balıkçı	W-64