Fosfolipaz Aktivite Testi: Anthopleura dowii'den Ham Venom Ekstraktında Fosfolipaz Aktivitesini Belirlemek İçin Bir Jel Difüzyon Testi

Özet

Kaynak: Ramírez-Carreto, S., et al., Deniz Anemonlarından Elde Edilen Ham Ekstraktlarda Hemolitik ve Fosfolipaz Aktivitesinin Basit Biyotahlillerle Tanımlanması. J. Vis. Uzm. (2022)

Bu videoda, bir deniz deniz anemonunu olan Anthopleura dowii'den elde edilen ham zehir ekstraktında fosfolipaz varlığını belirlemek için bir test gösteriyoruz. Test, fosfolipaz enziminin katı ortama dahil edilen fosfolipidleri radyal bir şekilde yaydığı ve parçaladığı bir agaroz jel difüzyon tekniği kullanır.

Protokol

1. Organizma koleksiyonu

1. Deniz anemonu A. dowii'yi toplayın.
   NOT: Burada organizmalar, Meksika'nın Kaliforniya eyaletindeki Ensenada Baja kıyılarındaki gelgit bölgesinde düşük gelgit dönemlerinde toplanmıştır (Şekil 1A, B). 
2. Organizmaları deniz suyu içeren kaplarda laboratuvara taşıyın (Şekil 1C).
3. Laboratuvarda, vücuda yapışan büyük substrat parçacıklarını çıkarmak için organizmaları elle damıtılmış su ile temizleyin.
4. Organizmaları hemen -80 °C'de ultra dondurucuda 72 saat dondurun.
5. Organizmaları, 48 saat boyunca -20 ° C, 0.015 psi liyofilizasyon koşullarıyla dondurarak kurutma için özel bardaklara yerleştirin.
6. Liyofilize organizmaları kullanana kadar -20 °C'de saklayın.

2. Doku hidrasyonu

1. 60 mL (1/3 a/h) 50 mM sodyum fosfat tamponu, pH 7.5 ve 1 inhibitör kokteyl tableti (Malzeme Tablosu) ile 20 g kuru liyofilize organizmaları sulandırın.
2. Manyetik bir karıştırıcıda, numuneyi 12 saat boyunca ~800 rpm, 4 °C'de sürekli olarak karıştırın.

3. Toksin salınımı

1. 
   

8. 
   
   
   

3. 
   

14. 
    

Sonuçlar

Şekil 1: Deniz anemonu koleksiyonu. (A) El Sauzal, Baja California Norte, Meksika'daki gelgit bölgesi. (B) Deniz anemonu toplandı. (C) Anthopleura dowii Verrill, 1869.

Tablo 1: Bradford testi ile protein miktarının belirlenmesi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
15 mL konik santrifüj tüpü	Corning	430766
2-Bromofenol mavisi	Sigma	B75808
2-merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250-100ML
50 mL konik santrifüj tüpleri	Corning	430828
Asetik Asit Buzulu	J.T. Fırıncı	9515-03
Akrilamid	Promega	V3115
agaroz	Promega	V3125 Serisi
Bisakrilamid	Promega	V3143 Serisi
Sığır Serum Albümin Fraksiyonu V	Sigma	A3059-100G
Bradford Protein Tahlilleri	Biyo-Rad	5000006
Kalsiyum klorür	Sigma-Aldrich	C3306
Hücre kültürü plakaları 96 kuyulu, V-alt	Corning	3894
merkezkaç	Eppendorf Belediyesi	5804R
Santrifüj tüpleri	Corning	CLS430829
ChemiDoc MP sistemi	Biyo-Rad	1708280
Sitrik asit	Sigma-Aldrich	251275
Clear flat.bottom 96 Kuyulu Plakalar	Termo Bilimsel	3855
Coomassie Parlak Mavi G-250	Biyo-Rad	#1610406
Coomassie parlak mavi R-250	Biyo-Rad	1610400
Dekstroz	J.T. Fırıncı	Ligi 1916-01
Kanalsız Muhafaza	Laboratuvar Laboratuvarı	dikey	https://imagej.nih.gov/ij ImageJ 1.53c
Jel Doc EZ	Biyo Rad.		Jel Dokümantasyon Sistemi
Gliserol	Sigma-Aldrich	G5516-4L
Hemositometre	Marienfeld	650030
ImageJ (Yazılım)	NIH, Amerika Birleşik Devletleri	Sürüm 1.53c
Kuluçka makinesi 211	Labnet Ağı	I5211 DS
metanol	J.T. Fırıncı	9049-03
Mini-PROTEAN tetra hücresi	Biyo-Rad	1658000EDU
Na2HPO4	J.T. Fırıncı	3824-01
NaCl (Doğal)	J.T. Fırıncı	3624-01
NaH2PO4.H2O	J.T. Fırıncı	3818-05
Origin yazılımı		Versiyon 9	Sigmoidal ayarlamalar ile grafiği tasarlamak
Petridiş	doğan	351007
Pipetman kiti	Gilson	F167380
Prekast mini jel	BioRad (BiyoRad	1658004
Önceden boyanmış protein merdiveni	Termo Bilimsel	26620
Proteaz İnhibitörü Kokteyli	Roche	11836153001
Protein Tahlili Boya Reaktif Konsantresi	Biyo-Rad	5000006
Rodamin 6G	Sigma-Aldrich	252433
SDS (Demokratik Güç)	Sigma-Aldrich	L4509
Sodyum sitrat dihidrat	JT Fırıncı	3646-01
Spektrofotometre	TERMO BİLİMSEL	G10S UV-VIS
Tris Tabanı	Sigma-Aldrich	77-86-1
Volt Güç Kaynağı	Hoefer Fabrikası	PS300B