1. Polidimetilsiloksan (PDMS) damgalarının imalatı
- CAD yazılımı kullanarak, iç çapı 250 μm ve dış çapı 450 μm olan bir dizi mikro ölçekli halka çizin. Bu protokolde kullanılan model, halkalar arasında 850 μm mesafe olan 10 x 10'luk bir dizidir.
- Bir mikrofabrikasyon şirketinin maske baskı hizmetini kullanarak desenin şeffaf bir maskesini istenen çözünürlükte yazdırın (bkz. Malzeme Tablosu).
not: Halkanın sağlanan boyutlarının birçok hücre tipi için işe yaradığı kanıtlanmıştır.
- Negatif bir fotorezist kalıbı (SU-8 gibi) yapmak için istenen özellikleri içeren maskeyi kullanarak ultraviyole (UV) fotolitografi yapın.
- Adım 1.1-1.2'de üretilen şeffaflık maskesi ile fotorezist ile döndürülmüş bir silikon gofret örtün.
- Bir UV temas hizalayıcısında, maskenin saydam bölgeleri altındaki fotorezisti UV ışığı ile polimerize edin.
not: Daha fazla yıkama ve geliştirmeden sonra, istenen özelliklere sahip ana kalıp üretilir. Operasyonel ayrıntılar, kullanılan özel ekipmana bağlıdır.
- PDMS elastomerik prepolimerlerini kürleme maddesi ile 10:1 oranında karıştırarak hazırlayın ve ardından karışımı bir Petri kabında kalıba dökün.
- PDMS'deki hava kabarcıklarını gidermek için kabı 30 dakika boyunca bir vakum odasına koyun ve 60 °C'lik bir fırında en az 2 saat pişirin.
- PDMS'nin tamamen kürlenmesinden sonra, desen dizilerini damgalar halinde kesin.
not: Mikrokontak baskının sonraki adımlarında kullanım kolaylığı nedeniyle daha kalın pullar (yaklaşık 1 cm) tercih edilebilir.
2. Cam slaytların kaplanması
- Cam slaytları temizleyin. Slaytları% 100 etanol banyosuna batırın, 5 dakika sonikat yapın ve ardından suyla durulayın.
- Bu adımı önce asetonla, ardından izopropanol ile tekrarlayın ve ardından bir nitrojen akışında kurutun.
- Cam slaytlar üzerine titanyum ve altın katmanları kaplamak için bir elektron ışını (E-ışını) buharlaştırma ekipmanı kullanın.
not: Titanyum tabaka için istenen kalınlık 15 Å'dir (1 ş= 10-10 m). Altın tabaka için istenen kalınlık 150 Å'dir. Titanyum tabakası altın ile cam slayt arasında bir yapıştırıcı görevi gördüğünden, önce titanyumu ve ardından altını kaplayın.
- Temizlenmiş slaytları buharlaşma odasına yerleştirin ve panjurların altına altın ve titanyum potalar yerleştirin.
- Metalleri eritmeden önce 10-5 Pa'dan daha düşük bir vakum oluşturmak için hazneyi aşağı doğru pompalayın. Elektron demetini metale odaklayın ve gücü, biriktirme hızı biriktirme kalınlığını kontrol etmek için uygun olacak şekilde ayarlayın.
- Metal biriktirme işlemini başlatmak için deklanşörü açın. İstenilen kalınlığa ulaşıldığında deklanşörü kapatın.
- İki metalin sıralı buharlaşması arasında potaları değiştirin.
- Ekipmanın gerektirdiği şekilde potaların soğumasını bekleyin, hazneyi boşaltın ve altın kaplamalı cam kızakları çıkarın.
- Ekipman bakımı için hazneyi tekrar aşağı pompalayın.
not: Operasyonel ayrıntılar, belirli bir E-ışını evaporatörüne bağlı olabilir. İyi kontrol edilen, düşük bir titanyum biriktirme oranına sahip olmak önemlidir. Kalın bir titanyum tabakası, özellikle hücrelerin floresan görüntülemesi için genellikle zayıf görünürlüğe yol açar. Kaplamadan sonra, titanyum / altın kaplı cam slaytlar en az 1 ay boyunca oda sıcaklığında kuru bir vakum odasında saklanabilir.
3. Mikro kontak baskı
- İsterseniz titanyum/altın kaplı sürgüyü daha küçük parçalar halinde kesin. Tipik bir uygulama için 12 mm x 12 mm'lik bir kare şekli önerilir (Şekil 1B).
- Girintili bir iz bırakmak için yüzey boyunca kaydırmak için bir cam kesici kullanın, ardından cam sürgüyü her iki taraftan tutun ve küçük parçalara ayırmak için göçükte bükün. Altınla kaplanmış yüzeye dokunmaktan kaçının.
not: Kazara devrilmesi durumunda camın hangi tarafının kaplanmış yüzey olduğunu görsel olarak belirlemek için, her iki taraftaki ışığın yansımasını karşılaştırın. Altın kaplı yüzey daha parlak bir yansıma gösterirken, kaplamasız taraf daha sönük bir yansımaya sahip olacaktır (camın diğer tarafındaki titanyum katmandan). Alternatif bir yol, sürgünün kenarlarını gözlemlemektir ve kaplama tarafı dikey kesme yüzeyinden belirlenebilir.
- Slaytları, altın tarafı yukarı bakacak şekilde bir orbital çalkalayıcı üzerinde bir Petri kabında %100 etanol içinde en az 10 dakika bekleterek temizleyin. Etanolü aspire edin, ardından her bir slaytı bir nitrojen akışı ile üfleyerek kurutun.
- PDMS damgalarını sabunlu su ve ardından %100 etanol ile temizleyin. Pulları nitrojen gazı ile kurutun.
- 5.74 mg C18 tozunu 10 mL% 100 etanol içinde çözerek 2 mM oktadekanatiol (C18) çözeltisi hazırlayın.
not: C18 çözeltisini kapatın ve oda sıcaklığında saklayın. C18 ile baskı desenleri, fibronektin ve hücrelerin tercihen bağlanacağı, yapışkan, kendinden montajlı bir tek tabaka oluşturur.
- PDMS damgalarını, desenli yüzey aşağı bakacak şekilde 10 saniye boyunca C18 solüsyonuna batırın ve nitrojen gazı ile 60 s.
not: Kuruturken, sıvının çoğu buharlaşana kadar akışı önce (yaklaşık 1 m) damgadan uzağa yerleştirin ve ardından damgayı tamamen kurutmak için akışı yavaşça yaklaştırın. Bu, damga üzerinde kurutmak yerine C18 çözeltisinin üflenmesini önlemek içindir.
- Çıkarmadan önce damgayı 60 saniye boyunca altın slaytların üzerine yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin.
- Düzgün damgalamayı sağlamak için, desenleri düzgün bir şekilde aktarmak için cımbızı damgaların üzerine hafifçe vurun. Çok sert bastırmayın ve cımbızın ağırlığı genellikle yeterlidir.
not: Kılavuz çekme sırasında damganın görsel olarak incelenmesi, damga ve cam sürgünün düzgün bir şekilde temas etmesini sağlayacaktır.
- Nem odalarını hazırlayın.
- 1 mL %70 etanolü ters çevrilmiş bir Petri kabı kapağına pipetleyin ve yüzeyi kaplamak için bir parça parafilm yerleştirin (yüzü yukarı bakacak şekilde).
- Kaldırmak için cımbız kullanın, hava kabarcığı olmamasını sağlamak için parafilm bırakın ve gerekirse fazla etanolü çıkarın.
- 2 mM HS-(CH2)11-EG3-OH (EG3) çözeltisi hazırlayın: 5 μL'lik stok çözeltisini 5 mL% 100 etanol içinde seyreltin.
not: Seyreltilmiş EG3 çözeltisi kapatılabilir ve 4 °C'de saklanabilir ve seyreltilmemiş EG3 stoğu -20 °C'de saklanmalıdır. EG3 işlemi, C18 içermeyen cam bölgesini hücrelere yapışmaz hale getirmek için kullanılır.
- Her çeyrek cam kayar için 40 μL'lik EG3 damlacıklarını nem odasındaki parafilm üzerine mikropipetleyin ve altın slaytların aralığını hesaba katmak için damlacıklar arasında yeterli boşluk bırakın.
- C18 baskılı altın slaytları yüzleri aşağı bakacak şekilde damlacıkların üzerine yerleştirmek için cımbız kullanın ve slaytların altında kabarcık olmadığından emin olun. Buharlaşmayı en aza indirmek için kızakları kaldırmadan nazikçe birbirine itin.
not: Cam kızakların bir kenarını damlacığın yanına yerleştirin ve ardından cam sürgüsün diğer ucunu yavaşça aşağı indirin. Bir baloncuk varsa, baloncuk artık mevcut olmayana kadar altın slaytı kaldırmadan itin.
- Petri kabını parafilm ile sıkıca kapatın ve en az 3 saat < br / > oda sıcaklığında bırakın
not: Kapsamlı inkübasyon isteniyorsa, Petri kabını iki kez kapatın ve 24 saate kadar bırakın.
- Bir biyogüvenlik kabininde, altın slaytları yüzü yukarı bakacak şekilde bir Petri kabına yerleştirin, EG3'ü çıkarmak için %70 etanolde 3 kez ıslatın ve durulayın, ardından sterilizasyon için 10 dakika etanolde bırakın.
- Etanolü aspire edin ve steril PBS ile değiştirin.
- Adım 3.9'da açıklandığı gibi, etanol yerine PBS ile başka bir nem odası hazırlayın.
not: Yüzey gerilimindeki farklılık nedeniyle, önce parafilmi yerleştirmek ve kabarcıkları çıkarmak için 4-5 mL PBS eklemek, ardından fazlalığı aspire etmek daha kolaydır.
- 50 μg / mL fibronektin çözeltisini (istenirse diğer proteinler) steril PBS içinde hazırlayın ve damlacıklar arasında biraz boşluk bırakarak parafilm üzerine her çeyrek kayma için 50 μL fibronektin çözeltisi damlacıkları mikropipetleyin.
not: Fibronektin kaplama, desenli yüzeylere hücre yapışmasını kolaylaştırır.
- Slaytları yüzleri aşağı bakacak şekilde damlacıkların üzerine yerleştirmek için gofret cımbız kullanın ve slaytların altında kabarcık olmadığından emin olun. Kızakları kaldırmadan nazikçe birbirine itin.
not: Slaytları tutmak için cam sürgülü cımbız veya düz geniş uçlu gofret cımbız önerilir.
- Petri kabını biyogüvenlik kabininde 30 dakika bekletin.
- 30 dakika sonra, 3 kez duruladıktan sonra altın slaytları yüzü yukarı bakacak şekilde PBS'ye yerleştirin.
not: Fibronektin desenli slaytlar PBS'de 4 °C'de yaklaşık bir ay saklanabilir.
4. Hücreleri mikro desenli slaytlara tohumlama
- Hücre kültürü ortamını ısıtın ve tripsini 37 ° C'lik bir su banyosunda ısıtın.
not: Aşağıdaki alt kültür açıklaması NIH/3T3 hücreleri içindir. Kültür koşulları hücre tiplerine bağlı olarak değişebilir.
- (İsteğe bağlı) Desenli slaytları 12 oyuklu bir plakada kültür ortamında bekletin, daha iyi hücre bağlanması için hücrelerin triplizasyonundan önce bir inkübatörde 37 ° C'ye kadar ısıtın.
- Hücreleri tripsinize edin, FBS içeren ortamla nötralize edin, 3 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleyin ve ardından taze ortamla iyice karıştırarak yeniden süspanse edin.
not: Hücrelerin birbirinden tamamen ayrıldığından emin olun.
- Hücreleri sayın, 200.000 hücre / mL'ye seyreltin ve bir altın slayt içeren her bir oyuğa 0.5 mL hücre süspansiyonu ekleyin.
- Düzgün hücre tohumlaması için kuyu plakasını birkaç kez hafifçe sallayın ve hücre yapışmasına izin vermek için 15 dakika boyunca bir inkübatörde saklayın.
- 15 dakika sonra, mikroskop altında hücre ekini kontrol edin. Gerekirse ek süre tanıyın.
not: Bağlı hücreler, görünür filopodyum veya düzleştirme ile yüzeye yayılacak ve kuyu plakasına hafifçe vurulduğunda veya hareket ettirildiğinde yüzeyden hareket etmeyecektir.
- Her bir oyuktan bağlanmamış hücreler içeren ortamı aspire edin ve 1 mL kültür ortamı ekleyin. İlaç tedavisi için, bu adımda kültür ortamına ek reaktifler ekleyin.
- Hücreleri inkübatörde 24 saat boyunca kültürleyin ve kiralitenin oluşup oluşmadığını belirlemek için birleşmeyi kontrol edin.
not: Çoğu hücre tipi için %75'in üzerinde birleşme önerilir ve aşırı birleşme kiralite karakterizasyonunu etkileyebilir.
5. Görüntü koleksiyonu
- Hücreleri birleştiğinde sabitleyin.
- Kültür ortamını kuyu plakasından çıkarın ve PBS ile bir kez durulayın.
- % 4 paraformaldehit çözeltisi ekleyin, oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin ve ardından PBS.
ile 3 kez durulayın
NOT: Fiksasyon hücre morfolojisini önemli ölçüde değiştirirse, fiksasyondan önce görüntüleme önerilir
- Kamera işlevine sahip bir faz kontrast mikroskobu kullanın, slaytlardaki her halkayı yüksek çözünürlükte görüntüleyin (analiz için 10x nesne lensi yeterlidir).
>6. Hücre kiralitesi karakterizasyonu (Şekil 2)
- Kiralite karakterizasyonu için MATLAB kod dosyalarını indirin.
- Kod klasörünü ve alt klasörleri (içinde dairesel istatistik araç kutusu bulunan) MATLAB yoluna ekleyin ve "ROI_selection.m" dosyasını açın. 4. satırda, dizini istediğiniz veri klasörüne değiştirin (Windows kullanıcıları için, 4. ve 5. satırlarda "/" yi "\" olarak değiştirin).
- 14. satırdaki görüntü boyutunu, ilk iki şekil halkanın iç daire boyutunu, diğer ikisi ise dış daireyi temsil edecek şekilde değiştirin.
not: Analiz edilecek bir klasördeki tüm görüntülerin boyutlarının aynı olduğundan emin olun.
- Faz kontrastlı görüntülerde ilgilenilen bölgeyi (ROI) belirlemek için "ROI_selection.m" MATLAB kodunu çalıştırmak için Çalıştır düğmesine tıklayın.
- Seçim karesini halkaya sığdırmak için manuel olarak sürükleyin, ardından seçimi onaylamak için görüntüye çift tıklayın.
- Klasördeki her görüntü için bu adımı tekrarlayın (önceki görüntünün ROI seçimini onayladıktan sonra bir sonraki görüntü otomatik olarak açılır); her görüntü için ROI bilgilerini depolamak için bir ".mat" dosyası oluşturulur.
- "Analysis_batch.m" dosyasını açın ve klasörün dizinini adım 6.2 ile aynı şekilde değiştirin. (Pencere kullanıcıları için, ilk kullanımda, 5, 6, 124 ve 130. satırlarda "/" ifadesini "\" olarak değiştirin)
- Birden fazla hücresel halka modelinin kiralitesini belirlemek için "Analysis_batch.m" kodunu çalıştırmak için Çalıştır düğmesine tıklayın. Her halka için dairesel istatistiklerin yanı sıra saat yönünde, kiral olmayan ve saat yönünün tersine halkaların sayılarını içeren bir "datatoexcel.txt" dosyası oluşturulacaktır.
