Hücre Dışı Vezikül Alım Testi: 3D Floresan Görüntüleme Tekniği Kullanarak Hücre Dışı Veziküllerin Hücresel Alımını Görselleştirmek ve Ölçmek İçin Bir Yöntem

Abstract

Kaynak: Kim, CJ ve diğerleri, Konfokal Mikroskop Görüntüleme Analizi ile Hücre Dışı Vezikül Alım Testi. J. Vis. Uzm. (2022).

Bu videoda, hücre dışı veziküllerin veya EV'lerin hücresel alımını görselleştirmek ve ölçmek için bir test gösteriyoruz. Bu test, konfokal bir mikroskop kullanarak 3D floresan görüntülemeyi kullanır ve içselleştirilmiş EV'leri hücre yüzeyine yapışanlardan ayırt etmeye izin verir.

Protocol

1. EV izolasyonu ve çip üzerinde immüno-floresan EV etiketleme

1. Hücre kültürü ortamının (CCM) toplanması ve EV izolasyonu için CCM'nin ön işlenmesi
   1. PC3 hücrelerini% 30'da tohumlayın^{75 cm2} hücre kültürü şişesinde. Kontrol hücrelerinin standart ortamda ve hücre hattına özgü takviyelerde %90 birleşmeye (~ 48 saat) kadar büyümesine izin verin.
      not: EV içeren bileşenlerin hücresel alımı etkilemesini önlemek için (ör., fetal sığır serumu), eksozom tükenmiş ortamlar ve takviyeler kullanın.
   2. CCM'yi hasat edin.
   3. CCM'yi oda sıcaklığında (RT) oda sıcaklığında (RT) 1000 x g'da 10 x g'da santrifüjleyin ve ortamla toplanan bağlanmamış hücreleri ve büyük kalıntıları topaklayın. Süpernatanı yeni bir konik tüpe aktarın.
   4. Yeni tüpte, ortamda kalan daha küçük kalıntıları ve apoptotik cisimleri peletlemek için süpernatanı 10.000 x g'da 4 ° C'de 20 dakika santrifüjleyin. Bazı büyük EV'ler peletlenecektir. Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın.
   5. Süpernatanı 0,45 μm hidrofilik Poliviniliden florür (PVDF) membran şırınga filtresinden süzün.
      not: EV izolasyonu için CCM'yi hemen işlemiyorsanız, önceden işlenmiş CCM'yi izolasyon gerçekleştirilene kadar -80 °C'de saklayın. Donmuşsa, donma-çözülme döngülerini bir ile sınırlayın.
2. Nano filtrasyon tabanlı bir mikroakışkan cihaz kullanarak CCM'den EV izolasyonu
   1. Donmuşsa, CCM'yi tamamen çözün ve adım 1.2.2'den önce 30 saniye boyunca girdap yapın.
   2. Nano filtrasyon bazlı mikroakışkan cihazın numune odasına 1 mL önceden işlenmiş CCM (adım 1.1) enjekte edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
      not: Nano filtrasyon tabanlı mikroakışkan cihaz için standart çalıştırma prosedürünü izleyin.
   3. Mikroakışkan cihazı çalıştırmak için tezgah üstü iplik eğirme makinesinde (Malzeme Tablosuna bakınız) 3000 rpm'de 10 dakika döndürün.
      not: İlk çalıştırmadan sonra CCM numune haznesinde kalırsa, numune haznesinden tüm CCM boşalana kadar ek dönüşler gerçekleştirin.
   4. Pipetleme yaparak sıvıyı atık haznesinden çıkarın ve 1.2.1, 1.2.2 ve 1.2.3 adımlarını iki kez tekrarlayın.
      not: Toplamda, EV izolasyonu için 3 mL CCM işlenecektir.
   5. İzole edilmiş EV'leri yıkamak için numune odasına 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) enjekte edin. Adım 1.2.3'te belirtildiği gibi mikroakışkan cihazı çalıştırmak için tezgah üstü iplik eğirme makinesinde döndürün. Cihazın zarındaki saf EV'leri bulun.
      not: Nano-filtrasyon tabanlı mikroakışkan cihazdan izole edilen EV'lerin kalitesi, özellikle, transmisyon elektron mikroskobu (TEM), taramalı elektron mikroskobu (SEM), nanopartikül izleme analizi (NTA), yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu, enzime bağlı immünosorbent testi ve gerçek zamanlı PCR ile konvansiyonel UC yöntemiyle karşılaştırıldı ve önceki araştırmada karşılaştırıldı.
3. Nano-filtrasyon tabanlı mikroakışkan cihaz kullanılarak EV'nin immünofloresan etiketlemesi (Şekil 1)
   1. Testin amacına göre EV'ye özgü bir antikor seçin (bkz. Malzeme Tablosu).
      not: Bazı antikorlar, EV alım yollarına özgü ligand bağlanma bölgelerine müdahale edebilir (ör., endositoz).
   2. 100 μL izole EV içeren cihazın elüsyon deliğine 1 μg/mL EV'ye özgü antikor enjekte edin.
   3. Antikorun numune boyunca eşit dağılımını sağlamak için RT'de karanlıkta 1 saat boyunca bir plaka çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
   4. Elüsyon deliğine yapışkan bir bant yapıştırın. Kalıntı antikorları yıkamak için numune haznesine 1 mL PBS enjekte edin.
   5. Numune haznesi boşalana kadar cihazı 3000 rpm'de döndürün. Pipetleme ile atık haznesindeki sıvıyı çıkarın. Numune haznesine 1 mL PBS enjekte edin.
      not: Floresan etiketli EV'ler membran odasına yerleştirilecektir.
   6. Floresan etiketli EV'leri (Şekil 2) membran odasından kehribar rengi bir tüpe pipetleyin. Kullanana kadar ışıktan engelleyin.

2. EV alım testi için hücrelerin floresan etiketli EV'lerle inkübasyonu

1. Hücre kültürüne uyumlu yemeklerde hedef hücre tohumlaması ve kültürü.
   1. 1 x 10⁴ PC3 hücresini, 0,2 mL ortam veya 4 x 10 4 PC3 hücresi ile 0,2 mL ortam veya 4 x 10⁴ PC3 hücresi ile 1 mL ortam içeren 35 mm'lik bir tabağa mikro slayt 8 oyuklu plakaya tohumlayın. Hücreleri, ince bir lamel (kalınlık: 0,18 mm) içeren hücre kültürüne uyumlu bir kaba koyun.
      not: İnce lamel ışığın ters saçılmasını en aza indirir.
   2. Hücrelerin optimum hücre kültürü koşullarında (37 °C, %5 CO₂ konsantrasyonu, %90 nem) gece boyunca yapışmasına izin verin.
   3. Yapışmış hücreleri eksozom tükenmiş ortamla iki kez yıkayın (adım 1.1.1'de açıklanmıştır).
2. Floresan etiketli EV'ler ile hücre inkübasyonu.
   1. Nanopartikül izleme analizi (NTA, Şekil 3) ile floresan etiketli EV'lerin konsantrasyonunu (adım 1.3.5) ölçün. Kültürlenmiş hücrelere eklenecek floresan etiketli EV'lerin optimal konsantrasyonunu belirleyin (adım 2.1.2.).
   2. Floresan etiketli EV'leri, adım 2.2.1'de ölçülen istenen konsantrasyona uyacak şekilde eksozom tükenmiş ortamla seyreltin. (yani, 200 μL eksozomu tükenmiş ortamda 7,80 x^{10 9} EV (NTA değerinde).)
   3. Seyreltilmiş EV'leri (Adım 2.2.2) 2.1.2'de hazırlanan yapıştırılmış hedef hücrelere ekleyin. Deneysel süre boyunca kuluçkaya yatırın (yani, 4, 8 veya 12 saat).
   4. İçselleştirilmemiş EV'leri çıkarmak için hücreleri eksozom içermeyen ortamla üç kez yıkayın.
      not: İsteğe bağlı: Hücreler yıkamadan sonra sabitlenebilir.
   5. Yapışan hücrelerin sitoplazmasını 1 μg/mL CMTMR ((5- (ve-6) - (((4-klorometil)benzoil)amino) tetrametilrodamin) ile etiketleyin ve optimum hücre kültürü koşullarında (37 ° C,% 5 CO₂ konsantrasyonu,% 90 nem) inkübe edin.
      not: Hücre alanı boyaları, EV alım tahlili sırasında çivili EV'lerin uzamsal konumunun (içselleştirilmiş veya yüzeysel) belirlenmesine yardımcı olmak için etiketli EV'lerden ayrı olarak floresan olmalıdır.
   6. Kalan boyayı çıkarmak için etiketli hücreleri eksozom tükenmiş ortamla iki kez yıkayın. Canlı hücre konfokal görüntülemeye hazırlık olarak hücrelere eksozom tükenmiş taze ortam ekleyin.

3. Konfokal mikroskopi

1. Canlı hücre görüntüleme yapmak için, optimum hücre kültürü koşullarını (37 °C, %5 CO₂ konsantrasyonu, %90 nem) korumak için sahnede bir inkübatör kullanın.
2. Hazırlanan hücreleri sahnedeki inkübatöre yerleştirin.
3. Görüntüleme parametrelerini kontrol örneklerine göre ayarlayın.
   not: Önerilen kontrol örnekleri şunları içerir: Yalnızca floresan etiketli EV'ler, floresan etiketli hücreler, etiketlenmemiş EV'ler ve etiketlenmemiş hücreler.
4. 3D konfokal görüntüler elde etmek için hedef hücrelerin derinliğini ve z yönünde istifleme boyutu aralığını belirleyin.
   not: Bir Z yığınının kalınlığı 1 μm'dir. Konfokal 3D görüntü alımı 2 dakika 34 saniye sürdü (her Z-düzlemi görüntü alımı yaklaşık 8 s; toplam yirmi Z-yığını görüntüsü).
5. Görüntü alımını aynı anda hem hücreye özgü boyanın (yani kırmızı) hem de EV'ye özgü boyanın (yani yeşil) birden fazla z yığınlı görüntüsüne ayarlayın (Şekil 4 ve Şekil 5A).

4. Görüntü işleme

1. Ham z-yığılmış konfokal görüntüleri analiz etmek ve hücreler tarafından EV alımını belirlemek için otomatik görüntü işleme yazılımını kullanın (bkz.
2. Eşik parametrelerini hücrelerin ve EV'ye özgü boyaların floresan sinyaline ayarlayın. Hücrelerin sanal yüzeylerini oluşturun (Şekil 5A,B).
   1. Hücrelerin sanal yüzeylerini oluşturmak için, Yeni Yüzeyler Ekle düğmesine tıklayın.
   2. Yazılım tarafından sağlanan algoritmayı kullanmak için "Algoritma Ayarları" olarak En Kısa Mesafe Hesaplaması'nı seçin ve ardından İleri: Kaynak Kanal'a tıklayın.
   3. Bu deneyde "Kaynak Kanal" olarak Kanal 2 - CMTMR'yi seçin.
   4. Pürüzsüz'ü seçin ve yüzey yumuşatma için "Yüzey Ayrıntısı"na uygun değeri girin.
      NOT: 1 piksel, ham görüntüleme verilerinde 0,57 μm'yi temsil ettiğinden, bu deneyde 0,57 μm.
   5. Mutlak yoğunluğu "Thresholding" (Eşikleme) olarak seçin.
   6. Floresan görüntüyü sağlanan algoritma ile otomatik olarak eşiklemek için Eşik (Mutlak Yoğunluk): Değer otomatik olarak ayarlanır.
   7. "Dokunan Nesneleri Böl (Bölge Büyütme)" olarak Etkinleştir'i seçin ve bu deneyde tahmini hücre boyutunun değerini "Tohum Noktaları Çapı", 10.0 μm olarak koyun. Ardından İleri'ye tıklayın: Tohum Noktalarını Filtrele.
   8. Sanal hücre yüzeylerini yapılandırmak için + Ekle düğmesini tıklayın ve ardından "Filtre Türü" olarak Kalite'yi seçin. Görsel bir inceleme ile alt sınır için uygun değeri (bu denemede 210) ve üst sınır için maksimum değeri (1485) eşikleyin, ardından Bitir düğmesine tıklayın.
      not: Görsel bir inceleme, bir araştırmacının hücresel alanı ham bir floresan görüntüden ayırt edebileceği anlamına gelir.
   9. Ardından, EV'lerin sanal noktalarını oluşturmak için düğmesine tıklayın Yeni noktalar ekleyin.
   10. "Algoritma Ayarları" olarak Farklı Spot Boyutları (Büyüyen Bölge) ve En Kısa Mesafe Hesaplaması'nı seçin, ardından İleri: Kaynak Kanalı'na tıklayın.
   11. Bu deneyde Kanal 1 - Alexa Fluor 488'i "Kaynak Kanal" olarak seçin.
   12. Bu deneyde 1 μm olan nokta tespiti için uygun değeri "Tahmini XY Çapı" na koyun. Ardından, İleri'ye tıklayın: Noktaları Filtrele.
   13. Sanal EV noktalarını yapılandırmak için + Ekle düğmesine tıklayın, "Filtre Türü" olarak Kalite'yi seçin ve bu deneyde 100 olan görsel bir incelemeyle "Alt Eşik"i ayarlayın. Ardından, İleri: Spot Bölge Türü düğmesini tıklayın.
   14. "Spot Bölgeler Türü" olarak Mutlak Yoğunluk'u seçin, ardından İleri: Spot Bölgeleri'ni tıklayın.
   15. EV noktalarının bölgesi olan eşiğe ulaşmak için, bu deneyde "Bölge Eşiği" olarak 100 olan görsel bir inceleme ile "Bölge Eşiği" içine uygun değeri koyun.
       not: Görsel bir inceleme, bir araştırmacının EV alanını ham bir floresan görüntüden ayırt edebileceği anlamına gelir.
   16. Bölge Hacmi'ni "Çap kaynağı" olarak seçin ve ardından Son'u tıklayın.
3. Adım 4.2'de inşa edilmiş yüzey içindeki gruplanmış noktaları bölmek için yazılımın sağladığı algoritmaları kullanın (Şekil 5C, i-iv).
   1. Yerleşik Noktalara tıklayın, ardından Filtreler'e gidin.
   2. + Ekle düğmesine tıklayın, ardından Yüzey Yüzeylerine En Kısa Mesafe = Yüzey 1'i Filtre Türü olarak seçin, ardından Seçimi Yeni Noktalara Çoğalt düğmesine tıklayın. Alt sınır için en düşük eşik (bu deneyde -7.0) ve üst sınır için uygun değer (-0.5).
      not: Spotların tahmini yarıçapı ile üst sınırı ayarlayın. Bu deneyde, Spotların, yani EV noktalarının tahmini çapı, adım 4.2.11'de 1 μm olarak ayarlandı; Böylece üst sınır 0,5 olabilir.
4. Hücrelerin içindeki EV'lerin otomatik sayımı
   not: Yazılım, hücrelerin içindeki EV'lerin sayısını otomatik olarak sayacak ve hedef hücreler tarafından içselleştirilen sayıyı gösterecektir.
   1. Yerleşik Noktalar 1 seçimine tıklayın [Yüzeylere En Kısa Mesafe Yüzeyler = -7.00 ile -0.500 arasındaki Yüzeyler 1].
   2. İstatistikler'e gidin ve "Toplam Nokta Sayısı"
      değerini dışa aktarın not: Yazılımın sağladığı algoritmalar, hücrelerin sayısını ve hacmini otomatik olarak hesaplayacaktır.
5. Yukarıda hesaplanan değerlere dayanarak inkübasyon süresi başına EV alımının verimini belirleyin (Şekil 6).
   1. Hücre sayısını elde etmek için, yerleşik Yüzeyler 1'e tıklayın, ardından İstatistikler'e gidin ve Genel'den "Toplam Yüzey Sayısı" değerini dışa aktarın.
   2. Hacmi Ayrıntılı'dan dışa aktarmak için İstatistiklere Ayrıntılı'ya gidin.

Results

Şekil 1: Nano filtrasyon tabanlı bir mikroakışkan cihaz kullanılarak EV izolasyonunun ve çip üzerinde etiketlemenin şematik gösterimi. (A) CCM'den EV izolasyonu. (B) EV'lerin çip üzerinde İmmünofloresan etiketlemesi. (C) Bağlanmamış antikorların uzaklaştırılması.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 488 anti-insan CD63 Antikoru	Biyoefsane	353038	Floresan boya konjuge EV spesifik antikor
CellTracker Turuncu CMTMR Boya	Thermo Fisher Bilimsel	C2927	Canlı hücre (sitoplazma) floresan etiketleme reaktifi
CFI Apo Lambda S 40XC WI	Nikon	MRD77400	Konfokal görüntüleme için amaç, NA=1.25
CFI Planı Apo VC 20X	Nikon	MRD70200	Konfokal görüntüleme için amaç, NA=0.75
Ekzodisk	Laboratuvar Döndürücü A.Ş.	Eski D1001	EV izolasyonu için nano filtrasyon tabanlı bir mikroakışkan cihaz
Exo Keşif	Laboratuvar Döndürücü A.Ş.	Eski R1001	Exodisc için çalıştırma cihazı
Eksozom tükenmiş FBS	Thermo Fisher Bilimsel	A2720801	PC3 hücre hattından türetilmiş EV koleksiyonu için hücre kültürü ortamının besin
Fetal sığır serumu (FBS)	VWR (VWR)	1500-500	Hücre yetiştiriciliği için besin
Keçi Anti-Fare IgG H & L önceden emilmiş	abcam (abcam)	AB7063	EV etiketlemesinin olumsuz kontrolü için fare IgG antikoru
Ibidi USA U DISH μ-Tabak 35 mm	İbidi	81156	Konfokal görüntüleme için kültür kabı
İmaris 9.7.1	Oxford Enstrümanları	9.7.1	Görüntü sonrası işleme yazılımı
İnkübatör Sistemi + CO2 / O2 / N2 gaz karıştırıcı	Canlı Hücre Enstrümanı	TU-O-20	Canlı hücre görüntüleme için inkübatör sistemi
Nikon A1 HD25 / A1R HD25 fotoğraf makinesi	Nikon	Na	Konfokal görüntüleme için kamera
Nikon Eclipse Ti mikroskobu	Nikon	Na	Konfokal görüntüleme için ters mikroskop
NIS Elemanları AR 4.50.00	Nikon	4.50.00	Nikon mikroskobu için görüntü işleme yazılımı
NTA, NanoGörüş NS500	Malvern Panalitik	NS500	EV konsantrasyonu için ölçüm cihazı
MenşeiPro 2020	Köken Laboratuvarı	9.7.0.185	Grafik yazılımı
Penisilin-Streptomisin	Thermo Fisher Bilimsel	15140122	Hücre yetiştiriciliği için antibiyotikler
dev/dak 1640	Thermo Fisher Bilimsel	21875034	PC3 hücre hattı yetiştiriciliği için hücre kültürü ortamı
SYTO RNASelect Yeşil Floresan Hücre Boyası - DMSO'da 5 mM Çözelti	Thermo Fisher Bilimsel	S32703 Serisi	EV etiketlemesi için RNA boyama floresan boyası