Hücre Dışı Vezikül Alım Testi: 3D Floresan Görüntüleme Tekniği Kullanarak Hücre Dışı Veziküllerin Hücresel Alımını Görselleştirmek ve Ölçmek İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Kim, CJ ve diğerleri, Konfokal Mikroskop Görüntüleme Analizi ile Hücre Dışı Vezikül Alım Testi. J. Vis. Uzm. (2022).

Bu videoda, hücre dışı veziküllerin veya EV'lerin hücresel alımını görselleştirmek ve ölçmek için bir test gösteriyoruz. Bu test, konfokal bir mikroskop kullanarak 3D floresan görüntülemeyi kullanır ve içselleştirilmiş EV'leri hücre yüzeyine yapışanlardan ayırt etmeye izin verir.

Protokol

1. EV izolasyonu ve çip üzerinde immüno-floresan EV etiketleme

1. Hücre kültürü ortamının (CCM) toplanması ve EV izolasyonu için CCM'nin ön işlenmesi
   1. PC3 hücrelerini% 30'da tohumlayın^{75 cm2} hücre kültürü şişesinde. Kontrol hücrelerinin standart ortamda ve hücre hattına özgü takviyelerde %90 birleşmeye (~ 48 saat) kadar büyümesine izin verin.
      not: EV içeren bileşenlerin hücresel alımı etkilemesini önlemek için (ör., fetal sığır serumu), eksozom tükenmiş ortamlar ve takviyeler kullanın.
   2. CCM'yi hasat edin.
   3. CCM'yi oda sıcaklığında (RT) oda sıcaklığında (RT) 1000 x g'da 10 x g'da santri....

Sonuçlar

Şekil 1: Nano filtrasyon tabanlı bir mikroakışkan cihaz kullanılarak EV izolasyonunun ve çip üzerinde etiketlemenin şematik gösterimi. (A) CCM'den EV izolasyonu. (B) EV'lerin çip üzerinde İmmünofloresan etiketlemesi. (C) Bağlanmamış antikorların uzaklaştırılması.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Alexa Fluor 488 anti-insan CD63 Antikoru	Biyoefsane	353038	Floresan boya konjuge EV spesifik antikor
CellTracker Turuncu CMTMR Boya	Thermo Fisher Bilimsel	C2927	Canlı hücre (sitoplazma) floresan etiketleme reaktifi
CFI Apo Lambda S 40XC WI	Nikon	MRD77400	Konfokal görüntüleme için amaç, NA=1.25
CFI Planı Apo VC 20X	Nikon	MRD70200	Konfokal görüntüleme için amaç, NA=0.75
Ekzodisk	Laboratuvar Döndürücü A.Ş.	Eski D1001	EV izolasyonu için nano filtrasyon tabanlı bir mikroakışkan cihaz
Exo Keşif	Laboratuvar Döndürücü A.Ş.	Eski R1001	Exodisc için çalıştırma cihazı
Eksozom tükenmiş FBS	Thermo Fisher Bilimsel	A2720801	PC3 hücre hattından türetilmiş EV koleksiyonu için hücre kültürü ortamının besin
Fetal sığır serumu (FBS)	VWR (VWR)	1500-500	Hücre yetiştiriciliği için besin
Keçi Anti-Fare IgG H & L önceden emilmiş	abcam (abcam)	AB7063	EV etiketlemesinin olumsuz kontrolü için fare IgG antikoru
Ibidi USA U DISH μ-Tabak 35 mm	İbidi	81156	Konfokal görüntüleme için kültür kabı
İmaris 9.7.1	Oxford Enstrümanları	9.7.1	Görüntü sonrası işleme yazılımı
İnkübatör Sistemi + CO2 / O2 / N2 gaz karıştırıcı	Canlı Hücre Enstrümanı	TU-O-20	Canlı hücre görüntüleme için inkübatör sistemi
Nikon A1 HD25 / A1R HD25 fotoğraf makinesi	Nikon	Na	Konfokal görüntüleme için kamera
Nikon Eclipse Ti mikroskobu	Nikon	Na	Konfokal görüntüleme için ters mikroskop
NIS Elemanları AR 4.50.00	Nikon	4.50.00	Nikon mikroskobu için görüntü işleme yazılımı
NTA, NanoGörüş NS500	Malvern Panalitik	NS500	EV konsantrasyonu için ölçüm cihazı
MenşeiPro 2020	Köken Laboratuvarı	9.7.0.185	Grafik yazılımı
Penisilin-Streptomisin	Thermo Fisher Bilimsel	15140122	Hücre yetiştiriciliği için antibiyotikler
dev/dak 1640	Thermo Fisher Bilimsel	21875034	PC3 hücre hattı yetiştiriciliği için hücre kültürü ortamı
SYTO RNASelect Yeşil Floresan Hücre Boyası - DMSO'da 5 mM Çözelti	Thermo Fisher Bilimsel	S32703 Serisi	EV etiketlemesi için RNA boyama floresan boyası

Serisi Serisi Serisi maddesi arası Serisi Serisi Serisi