Virüs Benzeri Parçacıklar Yakalama Testi: Nötralize Edici Antikor Konjuge Manyetik Boncuklar Kullanarak Antijen Gösteren VLP'leri Bir Numuneden İzole Etme Yöntemi

Özet

Kaynak: Rosengarten, J. F., et al. Yakalama Testi Kullanılarak Virüs Benzeri Parçacık (VLP) Bazlı Aşılarda Görüntülenen Antijenlerde Nötralizasyona Duyarlı Epitopların Tespiti. J. Vis. Uzm. (2022).

Bu videoda, bir numuneden antijen gösteren virüs benzeri parçacıkları veya VLP'leri izole etmek için VLP yakalama testi adı verilen bir immünopresipitasyon testi gösteriyoruz. Antijen, manyetik boncuklara bağlı spesifik antikorlarla bağlanır ve daha sonra ayrılan ve daha fazla analiz için saklanan hareketsizleştirilmiş bir antijen-antikor kompleksi oluşturur.

Protokol

1. Numune hazırlama

1. HIV yapısal genlerini eksprese eden 293-F hücrelerinden türetilen VLP üreticisi süspansiyon hücre hatlarını tohumlayın, tek başına veya env ile uyum içinde, 293-F Ekspresyon Ortamında mL başına 0.5 x^{10 6} hücrelik düşük hücre yoğunluğunda tıkır.
2. 3 cm'lik bir yörünge ve dakikada 8 tur (rpm) ile bir çalkalayıcı inkübatör dönüşünde 37 ° C ve% 8 CO 2'de 135-135 gün genleşmelerine izin verin.
3. Üretici hücreleri 5 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleme ile peletleyin. Hücresiz hücre kültürü süpernatantı (CFSN) elde etmek için 0.45 μm poliviniliden florür (PVDF) membran şırınga filtreleri kullanarak artık hücreleri ve hücre kalıntılarını gidermek için arıtılmış süpernatanı filtreleyin.
   NOT: Protokol buradan duraklatılabilir. CFSN gece boyunca 4 °C'de saklanabilir.
4. Ya deney için doğrudan CFSN'yi kullanın ya da ultrasantrifüjleme (112.700 x g, 4 ° C, 1.5 saat) kullanan 35 mL CFSN'den VLP'leri pelet
haline getirin.
5. Ultrasantrifüjleme üzerine, süpernatanı atın ve VLP peletlerini santrifüj tüpü başına 200 μL'lik %15 (a/h) trehaloz çözeltisi içinde askıya alın.
   NOT: VLP peleti genellikle çıplak gözle görülemez. Protokol buradan duraklatılabilir. VLP'ler –80 °C'de saklanabilir.
6. VLP yakalama testinden önce, bir ELISA kullanarak VLP içeren numunelerdeki viral çekirdek protein konsantrasyonlarını belirleyin. Bu adım, yakalama tahlil girişini standartlaştırmak için önemlidir.

2. VLP yakalama testi

NOT: İş akışına genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmiştir.

1. Manyetik boncukları yukarı ve aşağı pipetleyerek veya 50 rpm'de bir döndürücü üzerinde en az 5 dakika karıştırarak askıya alın.
2. Bu arada, bNAb'leri içeren antikor çözeltisini hazırlayın. Reaksiyon başına 200 μL antikor bağlama ve yıkama tamponunda (Malzeme Tablosuna bakınız) her bNAb'den 10 μg kullanın.
   NOT: Antikor miktarları, bNAb'nin afinitesine ve kullanılan VLP'ler üzerindeki antijen dekorasyon yoğunluğuna bağlı olarak değişebilir.
3. Reaksiyon başına 50 μL manyetik boncuk çözeltisi (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın ve boncukları 1.5 mL'lik bir reaksiyon tüpüne aktarın. Tüpleri manyetik ayırma rafına yerleştirin.
   NOT: Alternatif olarak, boncukları süpernatanttan ayırmak için her tüp için güçlü bir tek mıknatıs kullanılabilir.
4. Tüm boncukların toplandığından emin olmak için boncuklar tüp duvarında toplanana kadar birkaç dakika bekleyin. Süpernatanı çıkarın.
5. Mıknatısı çıkarın ve boncukları adım 2.2'de hazırlanan 200 μL bNAb çözeltisinde askıya alın. Oda sıcaklığında 50 rpm'de bir döndürücü üzerinde karıştırarak 30 dakika ila 3 saat inkübe edin.
6. Reaksiyon tüplerini tekrar manyetik ayırma rafına yerleştirin, bekleyin ve süpernatanı çıkarın.
7. Tüpleri mıknatıstan çıkarın ve 200 μL antikor bağlama ve yıkama tamponunda yeniden süspanse ederek boncukları yıkayın.
8. Adım 2.4'ü tekrarlayın. Mümkün olduğu kadar çok yıkama tamponunu çıkarın.
9. Örnekleri boncuk ciltli bNAbs.
   NOT: HIV'den türetilmiş partiküller kullanılarak yakalama testi için VLP girişi, reaksiyon başına en az 15 ng viral çekirdek proteini olmalıdır. VLP miktarları, bNAb'nin afinitesine ve kullanılan VLP'ler üzerindeki antijen dekorasyon yoğunluğuna bağlı olarak değişebilir.
10. Adım 2.9'da eklenen numune hacmi 1 mL'nin altındaysa, numune hacmini 1 mL'ye ayarlamak için PBS ekleyin. Pipetleme ile boncukları nazikçe asın.
11. Numuneleri ve boncukları oda sıcaklığında bir döndürücü üzerinde 2,5 saat inkübe edin. Boncukların süspansiyon halinde kaldığından ve inkübasyon sırasında çözeltinin iyice karıştırıldığından emin olun.
12. Tüpleri mıknatısın üzerine yerleştirin ve süpernatanı çıkarın.
13. Manyetik boncukları 200 μL yıkama tamponunda askıya alarak yıkayın (bkz. Malzeme Tablosu). Yıkama adımını üç kez tekrarlayın.
14. Boncukları 100 μL yıkama tamponunda askıya alın ve süspansiyonu temiz (ısıya dayanıklı) bir reaksiyon tüpüne aktarın.
15. Tüpü manyetik ayırma rafına yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın) ve süpernatanı tamamen çıkarın.
16. 2.16.1-2.16.2 adımlarını izleyerek denatüre SDS-PAGE numunelerini veya 2.16.3-2.16.5 adımlarını izleyerek VLP'leri manyetik boncuklardan ayırarak denatüre edilmemiş numuneleri hazırlayın.
    1. Denatüre SDS-PAGE numuneleri hazırlamak için, boncukları 20-80 μL Laemmli tamponunda (1 mg p55 Gag test girişi başına 0.8 μL Laemmli tamponu) askıya alın ve 95 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
    2. Doğrudan SDS-PAGE ile devam edin veya numuneleri -20 °C'de saklayın.
       DİKKAT: Laemmli tamponu 2-merkaptoetanol ve sodyum dodesil sülfat içerir. Koruyucu eldiven ve göz koruması kullanın. Cilt, göz ve giysilerle temasından kaçının. Buharları solumayın. Çeker ocak gibi iyi havalandırılan bir alanda çalışın.
       NOT: Protokol buradan duraklatılabilir.
    3. Alternatif olarak, korunmuş doğal protein yapısına sahip VLP'leri elde etmek için denatüre olmayan bir elüsyon adımı gerçekleştirin.
    4. Manyetik boncuklara 25 μL elüsyon tamponu (genellikle boncuklarla birlikte verilir) ekleyin ve oda sıcaklığında 2-5 dakika inkübe edin.
    5. Boncukları çıkarın ve elüatı temiz bir tüpe aktarın. Elüatı sonraki tahliller için kullanın veya 4 °C.
       'da saklayın NOT: Protokol buradan duraklatılabilir.

Sonuçlar

Şekil 1: Hücresiz süpernatanlar kullanılarak VLP yakalama testinin temel adımlarının şematik gösterimi. (1) VLP yakalama testi, HIV-1 bNAb'lerin protein G-bağlı manyetik boncuklara bağlanmasıyla başlar. Bu arada, tanımlanmış bir p55 konsantrasyonuna sahip VLP çözeltisi hazırlanır. Hücresiz kültür süpernatanı, p55 Gag VLP'ler, konak hücre proteinleri ve nükleik asitlerin bir karışımınd...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1.5 mL reaksiyon tüpleri	Eppendorf Belediyesi
10 adet PBS	Gibco Şirketi	70011044
Antikorlar (bnAbs)	Polymun Bilimsel
Dynabeads Protein G İmmünopresipitasyon Kiti	invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	10007D	tamponlar ve yıkama içerir Çözümleri
Serbest Stil 293-F hücreleri	invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	R790-07
FreeStyle 293 İfade Ortamı	invitrogen (Thermo Fisher Scientific)	12338026
Manyetik ayırma rafı	New England Biyolojik Laboratuvarları	S1509S	12 x 1,5 mL veya 6 x 1,5 mL tüpler için
Optima XE-90 ultrasantrifüj	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.
Poliviniliden florür (PVDF) Şırınga filtreleri, 0,45 μm	Carl Roth'un fotoğrafı	KC89.1
PVDF transfer membranı, 0,45 μm	Carl Roth'un fotoğrafı	T830.1 Serisi
QuickTiter HIV p24 ELISA	Hücre Biyolaboratuvarları	VPK-108-H
Rotator	Heidolph	REAX2
SW28 rotor	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.
Termo karıştırıcı	Cel Medya	temel
Trehaloz dihidrat	Carl Roth'un fotoğrafı	8897.2
Ultra Berrak santrifüj tüpleri	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	344058