$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Yeni hazne tasarımı (Şekil 1)
- Yeni bir çift odacıklı hücre analizör plakası açın. Üst bölmeyi elektrotlarla bir kenara koyun.
- Bir freze makinesi kullanarak, hücre analizör plakasının U şeklindeki alt kuyularının 2 mm'sini tıraş edin.
- UV kürlü yapıştırıcı kullanarak traş edilmiş kuyucukların dibine 0,2 μm gözenek boyutuna sahip 2 cm x 7 cm polietersülfon (PES) membran takın. Yapıştırıcının tamamen kürlendiğinden ve inert olduğundan emin olmak için 30 dakikalık kürleme süresine izin verin.
- Bir freze makinesi kullanarak, yeni imal edilen üçüncü haznenin sırtlarına oturmak için yanlar boyunca iki uzunlamasına yarık (1,5 mm x 5,6 mm) kesin.
- Bir freze makinesi kullanarak, hücre analizör plakasının genel boyutlarını kopyalayan üçüncü bir polikarbonat odası oluşturun; 72 mm x 18 mm (Malzeme Tablosu).
- Hücre analizör plakasının 16 oyuklu tasarımını çoğaltmak için 4,8 mm derinliğinde ve 4,75 mm çapında kuyular oluşturun. Bu, kuyu başına 90 μL hacme izin verir.
- Yanlarda, haznenin adım 1.4'te oluşturulan orijinal yarıklara kilitlenmesi için iki üçgen çıkıntı oluşturun. Üçgenin yatay kısmı 1,5 mm, dikey kısmı 1,4 mm ve hipotenüsü 2,052 mm'dir.
- Kısa kenarda, orijinal plakanın çentiğine sığması için 50.8 mm çapında ve 1.397 mm yüksekliğinde bir düğme oluşturun (Şekil 1, Orta).
- Sızdırmaz bir uyum sağlamak için her kuyu için 0,9 mm kalınlığında bir lastik rondela kullanın.
2. Hücre kültürü (MDA-MB-231, DCIS, DCIS-Δ4, J2-fibroblastlar)
- Yapışkan hücre kültürlerini (~% 70 birleşme) 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
- Hücreleri kaldırmak için% 0.05 tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin.
- Tripsin çözeltisini serum içeren hücre kültürü ortamı ile nötralize edin ve hücre süspansiyonunun bir alikotunu kullanarak hücreleri sayın.
not: Spesifik hücre kültürü ortamı Tablo 1'de bulunabilir.
3. Hasta kaynaklı ksenogreft ayrışması
- Steril bir neşter kullanarak taze bir tümör parçasını (1cm2) ince lapa haline getirin.
- 3 mg / mL tripsin ve 2 mg / mL kollajenaz ile desteklenmiş 20 mL DMEM F12 ortamı ile 50 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin.
- Termal çalkalayıcıda (150 RPM) 37°C'de 20 dakika inkübe edin.
- Tüpü 5 dakika boyunca 500 x g'da döndürün; süpernatanı çıkarın.
- Hücreleri yıkamak için 20 μL DMEM F12 +% 2 FBS ekleyin; 5 dakika boyunca 300 x g'da döndürün ve süpernatanı çıkarın. Yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
- Hücreleri saymak için 1 mL PDX ortamında (Tablo 1) yeniden süspanse edin.
4. Kemik iliği hücre ekstraksiyonu
- Kemik iliği (BM) toplama filtresini 25 mL 1x PBS ile yıkayın.
not: Bu çalışmada, hastaneden kullanılan bir BM toplama filtresine, filtrede kalan BM'yi toplamak için PBS eklenmiştir.
- Yıkanmış BM'yi, katmanları mümkün olduğunca ayrı tutmaya özen göstererek, 25 mL yoğunluk gradyan ortamına sahip 50 mL'lik konik bir tüpe yavaşça ekleyin.
- 18 °C'de 20 dakika boyunca 800 x g'da döndürün.
- Santrifüjlemeden sonra üst katmanları (yağ / plazma) sifonlayın ve BM hücrelerine sahip yoğunluk gradyan ortamının üzerindeki beyaz katmanın 5 mL'sini 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
not: Alternatif olarak, 5 mL'lik bir pipeti orta katmana (BM) değene kadar üst katmana batırın ve pipeti hareket ettirmeden orta katmanı çok yavaş bir şekilde pipetleyin.
- 15 mL konik tüpü 1x PBS (~ 10 mL) ile doldurun ve 300 x g'da 15 dakika döndürün.
- Süpernatanı çıkarın; kalan beyaz pelet BM'dir.
- Pelette kırmızı kan hücreleri görülürse, 5 mL RBC lizis çözeltisi ekleyin (Malzeme Tablosu) ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika bekletin. 5 dakika boyunca 300 x g'da döndürün ve süpernatanı çıkarın.
- Hücreleri yıkamak için 10 mL 1x PBS ekleyin, 5 dakika boyunca 300 x g'da döndürün ve süpernatanı çıkarın. Pelet beyaz olana kadar RBC lizizini (adım 4.7) tekrarlayın.
5. Hücre tohumlama ve birleştirme
- Üç steril odayı da doku kültürü başlığına yerleştirin.
- Alt bölmenin kısa tarafındaki düğmeyi bulun. Alt bölmeyi, düğme deneyciye bakacak şekilde yönlendirin.
- Alt bölmenin her bir oyuğuna 90 μL ortamda 30.000-50.000 hücre ekleyin. Kabarcık oluşturmaktan kaçının. Bunlar, salgılanan faktörleri sağlayacak ancak üst haznenin elektrotları tarafından tespit edilmeyecek olan stromal hücrelerdir.
- Hücre motilitesi için pozitif bir kontrol olarak iki alt odacıklı kuyucukta% 5 fetal sığır serumu takviyeli ortam kullanın. Negatif kontrol olarak %0 serum takviyeli ortam kullanın.
- Hücrelerin bulunduğu alt haznenin oturması için davlumbazda 10-15 dakika bekletin.
not: Bu adım, hücreler yapışıksa veya süspansiyon halinde büyüyorsa önerilir.
- Alt hazneyi 90° döndürün ve alt haznedeki düğme orta haznedeki çentiğe kayar şekilde orta hazneyi üstüne yerleştirin.
not: Alt haznedeki topuz ve orta haznedeki mavi nokta, tertibatın zıt uçlarındadır.
- Düzeneğin uzun kenarlarının her birinden bir klik sesi duyulana kadar dikey olarak aşağı itin.
- Orta haznenin tüm kuyucuklarına 160 μL serumsuz ortam ekleyin.
- Kuyucuklar doldurulduktan sonra kubbe şeklinde bir menisküsün göründüğünden emin olun; aksi takdirde, son hacmi pipet kalibrasyonuna göre ayarlayın. Kabarcık oluşturmaktan kaçının.
- Üst bölmeyi, elektrotlar aşağı bakacak şekilde orta bölmeye yerleştirin, orta ve üst bölmelerdeki mavi noktaları hizaladığınızdan emin olun.
- Düzeneğin uzun kenarlarının her birinden bir klik sesi duyulana kadar dikey olarak aşağı itin.
- Üst hazneye 25-50 μL serumsuz ortam ekleyin.
- Düzeneği, doku kültürü inkübatöründeki çift amaçlı hücre analizörüne monte edin ve arka planı ölçmeden önce 30 dakika bekleyin.
not: Bu süre, diziyi dengelemek için gereklidir ve üst bölmeye eklenecek hücre hatlarını hazırlamak için kullanılabilir.
- Arka planı ölçün (bkz. bölüm 6) ve düzeneği doku kültürü başlığına geri yerleştirin.
- Üst haznenin her bir oyuğuna 100 μL serumsuz ortamda 30.000-50.000 hücre ekleyin. Bunlar, elektrotun zardan başarılı bir şekilde geçtikten sonra algılayacağı hücrelerdir
not: Maksimum yanıt elde etmek için, testi gerçekleştirmeden önce hücrelerin serumsuz veya düşük serumlu ortamlarda 6-18 saat boyunca büyütülmesi önerilir.
- Empedans ölçümü için çift amaçlı hücre analizörüne monte etmeden önce düzeneğin davlumbazda 30 dakika
bekletilmesine izin verin.
6. Arka plan ve empedans ölçümü
- Diziyi çift amaçlı hücre analizörü cihazının kızağına yerleştirin.
- Hücre analizörü yazılımını açın ve kullanılacak yuvayı seçin.
- Mesaj sekmesine tıklayın ve dizinin yuvaya iyi yerleştirildiğinden ve elektrotların sensörlerle iyi bir şekilde hizalandığından emin olmak için Bağlantılar Tamam yazdığından emin olun.
- Deney Notları sekmesine tıklayın ve deney hakkında mümkün olduğunca fazla bilgi doldurun.
- Düzen sekmesine tıklayın ve dizi düzeninin açıklamasını doldurun.
- Zamanlama sekmesine tıklayın ve Adımlar menüsünden iki adım ekleyin; bir arka plan adımı (bir tarama) ve 100 taramalı bir test adımı, her 15 dakikada bir tarama, toplam 25 saat.
- Dizi, çift amaçlı hücre analizörü inkübatöründe 30 dakika kaldıktan sonra, arka plan ölçümünü başlatmak için Oynat düğmesine tıklayın. Verilerin kaydedileceği klasörü seçmenizi isteyen bir pencere açılacaktır.
- Arka plan ölçümü yapıldıktan sonra, diziyi yuvadan çıkarın ve hücre kültürü başlığına geri yerleştirin.
- Hücreleri adım 5.13'te açıklandığı gibi üst hazneye ekleyin ve hücrelerin yerleşmesi için düzeneği 30 dakika doku kültürü başlığında tutun.
- Diziyi çift amaçlı hücre analizörüne geri yerleştirin ve Bağlantılar Tamam mesajı için Mesaj sekmesinde kontrol edin.
- Empedans ölçümünü başlatmak için Oynat düğmesine tıklayın.
- Sinyalin ilerlemesini izlemek için Çizim sekmesine tıklayın.
- Uç noktaya 25 saatten önce ulaşılırsa, Yürüt açılır menüsünden İptal adımına tıklayın.
- Verileri dışa aktarmak için grafiğe sağ tıklayın, liste biçiminde Kopyala'yı seçin ve ardından verileri bir elektronik tabloya yapıştırın.
not: Veriler hücre indeksi veya delta hücre indeksi olarak dışa aktarılabilir. Dışa aktarma için grafik ve/veya düzen bilgileri de seçilebilir.
Tablo 1: Hücre kültürü ortamı bileşimi. Tablo, MDA-MD-231 ortamı, J2 Fibroblasts ortamı, DCIS ortamı ve PDX ortamının bileşimlerini listeler.
Serisi
Serisi
| medya | Bileşen | Konsantrasyon / oran |
| MDA-MD-231 ortamı | DMEM (Ömer Çiçeğ | |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | %10 |
| J2 Fibroblast ortamı | DMEM (Ömer Çiçeğ | |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | %10 |
| DCIS ortamı | DMEM F12 | |
| At serumu (HS) | %5 |
| Epidermal büyüme faktörü (EGF) | 20 ng/mL |
| Insülin | 10 μg/mL |
| Hidrokortizon | 0,5 μg/mL |
| Kolera toksini | 100 ng/mL |
| PDX ortamı | DMEM F12 | |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | %2 |
| HEPES ÜNİVERSİTESİ | 1 AYLIK |
| İnsülin Transferrin Selenyum Etanolamin (ITS) | 10 μg/mL |
| Hidrokortizon | 0,5 μg/mL |
| Sığır serum albümini (BSA) | 1 mg / mL |
