Sitrat Sentaz Aktivite Testi: Drosophila Doku Homojenatında Mitokondriyal Sitrat Sentaz Aktivitesini Ölçmek İçin Kolorimetrik Bir Test

Özet

Kaynak: Wei, P., et al., Drosophila Melanogaster'de Sitrat Sentaz Aktivitesinin Kolorimetrik Bir Testi. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu videoda, Drosophila'nın doku homojenatında bulunan mitokondriyal sitrat sentaz aktivite testini ölçmek için bir kolorimetrik test açıklanmaktadır.

Protokol

1. D. melanogaster için Kolorimetrik Sitrat Sentaz Aktivite Testi

1. Her örnek için on yetişkin sinek toplayın. Her genotip için en az üç kopya örnek toplayın.
2. Her numune için 1,5 mL'lik bir test tüpünde 20 mM HEPES (pH = 7,2), 1 mM EDTA ve %0,1 triton X-100 içeren 500 μL buz gibi soğuk ekstraksiyon tamponu hazırlayın.
3. Yetişkin sinekleri bir anestezi pedi üzerinde CO₂ ile uyuşturun ve istenen dokuları izole edin. Örneğin, yetişkin sinek torakslarını izole etmek için, sinek torakslarını bir çift forseps ile sabitleyin ve ardından bir makas kullanarak göğüs kafesi ve karın kenarı boyunca keserek sinek karınlarını izole edin. Kas sitrat sentaz aktivite testi için sinek torakslarını toplayın.
   not: Sitrat sentaz aktivitesini normalleştirmek için kullanılıyorsa, bu adımda dokunun taze ağırlığını belirleyin.
4. 10 yetişkin sinek toraksını hemen 100 μL buz gibi soğuk ekstraksiyon tamponuna aktarın ve buz üzerinde bir havaneli ile homojenize edin. Numuneleri buz gibi soğuk tutmak için, numuneleri buz üzerinde 5-10 saniye homojenize edin, ardından numuneleri 5 saniye buz üzerinde bekletin ve tüpteki tüm dokular tamamen homojenize olana kadar tekrarlayın.
   not: Tüpü bantlayın, homojenatlarda pıhtı olmadığından ve tüp içindeki dokuların tamamen homojenize olduğundan emin olmak için homojenatları kontrol edin. Tüm örnek tedavileri buz üzerinde yapılmalıdır.
5. Protein içeriği ölçümü için yeni bir tüpte her homojenize numuneden 10 μL alın. Protein ölçümü için numuneleri ice.
   üzerinde saklayın not: Protein örnekleri dondurulabilir ve daha sonra analiz edilmek üzere -80 °C'de saklanabilir. Protein konsantrasyonları, sitrat sentaz aktivitelerinin normalizasyonu için dahili bir parametre görevi görür.
6. Toplam 500 μL hacim elde etmek için kalan her numuneye 400 μL buz gibi soğuk ekstraksiyon tamponu ekleyin. Kabarcık oluşumunu önlemek için en az 5 kez yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek iyice karıştırın. Her reaksiyon için, 150 μL taze hazırlanmış reaksiyon çözeltisine (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 mM DTNB, 0.3 mM asetil CoA, 1 mM oksaloasetik asit) 1 μL seyreltilmiş hücre lizatı ekleyin. Kabarcık oluşumunu önleyerek nazikçe pipetleyerek iyice ve hemen karıştırın. Minimum 10 s.
   aralıklarla 412 nm'de absorbansı ölçebilen bir plaka okuyucu kullanarak 25 ° C'de 4 dakika boyunca her 10-30 saniyede bir 412 nm'de absorbansı ölçün not: Farklı bir reaktifi pipetlemeden önce ucu değiştirin ve kuyucuklarda kabarcık oluşmasını önleyin. Reaktiflerin eksik karıştırılması ölçümlerde değişikliklere neden olabilir. Sitrat sentaz aktivite testi, numuneler toplandıktan hemen sonra oda sıcaklığında yapılmalıdır, çünkü bu test bozulmamış mitokondriyal kütleyi ölçmek için kullanılır. Reaksiyon tamponu kullanımdan hemen önce hazırlanmalı ve saklanmamalıdır.
7. Verileri optik yoğunluk (OD), absorbans (abs) (Y ekseni) ve zamana (dakika cinsinden) (X ekseni) göre çizin. Ardından, reaksiyon hızının
   olduğu eğrinin doğrusal kısmı için eğimi hesaplayın
   Sitrat sentaz aktivitesini normalleştirmek için değeri örnek protein konsantrasyonuna bölün. Sitrat sentaz aktivitesi şu şekilde hesaplanır
   
   not: Numune protein konsantrasyonu, bir protein konsantrasyonu test kiti ile ölçülebilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2- [4- (2-Hidroksietil) -1-piperazinil] etansülfonik asit (HEPES)	Sigma-Aldrich	V900477
2-Amino-2-(hidroksimetil)-1,3-propandiol (TRIZMA Bazı)	Sigma-Aldrich	V900483
Asetil-CoA	Sigma-Aldrich	A2181
Ditiyo-bis-nitrobenzoik asit (DTNB)	Sigma-Aldrich	D8130
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)	Sigma-Aldrich	V900106
Oksaloasetat	Sigma-Aldrich	O4126
Pelet havaneli	Sangon Belediyesi	F619072
Pelet havaneli motoru	Tiangen Belediyesi	İşletim Sistemi-Y10
Plaka okuyucu	BioTek	Eon
Protein BCA Test kiti	Beyotime	P0010S Serisi
makas	TEFE	14124
Triton X-100	Sangon Belediyesi	A110694-0100

Gazetesi Gazetesi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Gazetesi Serisi Teknolojisi Serisi