Lizostafin Bazlı Enzim Koruma Testi: Hücre Dışı Bakterilerin Enzim Aracılı Seçici Öldürülmesiyle Hücre İçi Staphylococcus aureus Yükünü Ölçmek İçin İn Vitro Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Rigaill, J. et al. Antimikrobiyal Bileşiklerin Staphylococcus aureus İçselleştirmesini ve Hücre İçi Etkinliğini İncelemek İçin Geliştirilmiş Enzim Koruma Testi. J. Vis. Uzm. (2021).

Bu videoda, A549 hücrelerinde Staphylococcus aureus içselleştirmesini ölçmek için lizostaphin bazlı bir in vitro enzim koruma testi gösteriyoruz. Test, konakçı hücrelerdeki hücre içi bakteri yükünün kalitatif, kantitatif ve karakterizasyon çalışmalarına yardımcı olur.

Protokol

1. Hücre aşılaması

1. Antibiyotiksiz% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş, Dulbecco'nun fenol kırmızısı ile modifiye edilmiş Eagle ortamı (DMEM) yüksek glikozunda A549 insan epitel hücrelerinin bir kültürü ile başlayın.
2. İnsan epitel hücrelerinin sağlıklı olduğundan ve beklendiği gibi büyüdüğünden emin olmak için 24 oyuklu plakanın her kuyusunu düşük büyütme mikroskobu ile gözlemleyin.
3. Harcanan hücre kültürü ortamını 24 oyuklu plakadan çıkarın ve atın.
4. Her bir oyuğa% 100 birleşik hücrelerle aşılama için fenol kırmızısı olmadan DMEM'de hazırlanan Staphylococcus aureus'un bakteriyel süspansiyonundan 500 μL ekleyin.
5. Hücreleri 36 ± 1 ° C'de ve %5 CO₂.
   'da 2 saat inkübe edin NOT: Test edilecek her koşul için plakanın üç kuyusunun kullanılması (üç katlı) ve en az üç bağımsız deney yapılması önerilir. İnkübasyon gecikmesi deneysel amaca göre uyarlanabilir.

2. Geliştirilmiş enzim koruma testi (iEPA) ile hücre içi bakterilerin miktar tayini

1. Steril suda 3.5 mL% 2 Triton X-100 ve 3.5 mL tripsin-EDTA ile 7 mL 4x lizis tamponu hazırlayın.
2. Asetat tamponunda 10 mg / mL'de bir lisostaphin stok çözeltisi hazırlayın ve 25 μL'yi kriyoviyallere ayırın. -80 °C'de 6 aya kadar saklayın.
3. 25 μL lisostafin stok çözeltisi (10 mg / mL) ve 225 μL 0.1 M Tris-HCl'yi karıştırarak 1 mg / mL'de 250 μL taze bir lisostaphin çalışma çözeltisi hazırlayın. 4 °C'de 48 saate kadar saklayın.
4. 250 μL lisostaphin çalışma çözeltisine 6 mL tam enfeksiyon ortamı ekleyerek lizostaphin ile desteklenmiş 6.25 mL tam enfeksiyon ortamı hazırlayın.
5. Her bir oyuğa lizostafin ile takviye edilmiş 250 μL tam enfeksiyon ortamı ekleyin ve plakayı elle döndürerek plakayı hafifçe çalkalayın.
6. Lizistafinin hücre dışı bakterileri öldürmesine izin vermek için hücreleri 36 ± 1 ° C'de% 5_CO2'de 1 saat inkübe edin.
7. İnkübasyon süresinin sonunda, lisostafini inaktive etmek için her bir oyuğa 20 mg / mL'de 10 μL proteinaz K ekleyin.
8. Hücreleri oda sıcaklığında 2 dakika inkübe edin.
9. Hücreleri ozmotik şokla parçalamak için 250 μL 4x lizis tamponu ekleyin.
10. Hücreleri 36 ± 1 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
11. Hücrelerin tamamen parçalanmasını ve homojenize olmasını sağlamak için kuyunun dibine on kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.
12. Her kuyucuğun S. aureus yükünü belirlemek için otomatik bir spiral plater kullanın.
13. Agar plakalarını 36 ± 1 °C'de 18-24 saat inkübe edin.
14. Ertesi gün, her bir oyuğun hücre içi S. aureus yükünü hesaplamak için bir koloni sayacı ile koloni sayısını sayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
24 oyuklu plaka	CORNING-FALCON	353047
A549 hücre hattı	ATCC (Uzay Servisi)	CCL-185
Asetat tampon çözeltisi pH 4.6	Fluka Çiçeği	31048	20 mM sodyum asetat içinde 10 mg / mL'de lisostpahin stok çözeltisi hazırlamak için kullanılır.
AMBICIN (Rekombinant lizostafin)	AMBI (AMBIYANS	LSPN-50	Liyofilize rekominant lizostafin. Uzun süreli depolama için -80 °C'de dondurun.
COS - Kolombiya agar +% 5 koyun kanı	Biyomeriö	43049	Bunun yerine stafilokok yetiştirmek için uygun herhangi bir agar plakası kullanılabilir.
Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium, fenol kırmızısı ile yüksek glikoz	Sigma-Aldrich	D6429
Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium, fenol kırmızısı içermeyen yüksek glikozu	Sigma-Aldrich	D1145
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu Suyu	Sigma-Aldrich	D8537
Dulbecco'nun MgCl2 ve CaCl2 içeren Fosfat Tamponlu Salin, steril filtrelenmiş	Sigma-Aldrich	D8662
Dulbecco'nun Fosfat tamponlu Salin, steril filtreli	Sigma-Aldrich	D8537
Easyspiral seyreltik	Bilimlerarası	414000	Otomatik seyreltici ve spiral plater
Fetal sığır serumu	Gibco (Gibco)	10270-106
Proteinaz K, rekombinant 20 mg/mL	Eurobio (Avrupa Borsası	GEXPRK01-B5	> 30 U/mg, çok 901727
Tarama 4000	Bilimlerarası	438000	Otomatik koloni sayacı
Steril su	OTEC (Türkçe)	600500
TC20 Otomatik hücre sayacı	Biyorad	1450102	Otomatik hücre sayacı
Tris 1 M pH 8.0	Canlandırıcı	AM9855G	0.1 M Tris-HCl'de 1 mg / mL'de lisostafin çalışma solüsyonu hazırlamak için kullanılır.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tripsin - EDTA çözeltisi	Sigma-Aldrich	T3924 Serisi	%0.05 domuz tripsin ve %0.02 EDTA, Hanks'in fenol kırmızısı içeren Dengeli Tuz Çözeltisinde
Geniş alanlı floresan mikroskobu	Nikon	Ti2