$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir
.
1. Çözelti hazırlama
>NOT: Tüm reaktifleri ve solüsyonları demir içermeyen cam eşyalar veya tek kullanımlık plastik malzemelerle kullanın ve hazırlayın. Demir kontaminasyonu riski nedeniyle metalik laboratuvar malzemelerinin (örn. paslanmaz çelik spatulalar) herhangi bir reaktif veya çözelti ile temas etmesine izin vermeyin. Yeniden kullanılabilir cam eşyaların ütü içermediğinden emin olun. Malzemeleri uygun laboratuvar deterjanı ile 30-60 dakika yıkayın, deiyonize su ile durulayın, gece boyunca 1:3 oranında deiyonize su ile seyreltilmiş 7 nitrik asit solüsyonunda bekletin, tekrar deiyonize su ile durulayın ve kurumaya bırakın.
- Asit karışımı: Bir cam şişede 82,2 mL 7 hidroklorik aside 10 g trikloroasetik asit ekleyin, iyice çözün ve son hacmi deiyonize su ile 100 mL'ye ayarlayın. Kullanmadan önce çalkalayınız. Alternatif olarak, doku sindirimi için sadece% 37 hidroklorik asit kullanın.
not: Çözelti, koyu kahverengi cam reaktif şişelerinde saklandığında en az 2 ay stabildir.
Dikkat: Hidroklorik asit ve trikloroasetik asit aşındırıcıdır ve konsantre formlar toksik asidik buharlar açığa çıkarır. Asitlerle çalışırken her zaman koruyucu giysiler, kimyasallara dayanıklı eldivenler ve kimyasal sıçrama gözlükleri kullanın. Onları solumaktan kaçının ve çeker ocak altındayken her zaman asitleri kullanın.
- Doymuş sodyum asetat: Bir cam şişede 400 mL deiyonize suya 228 g susuz sodyum asetat ekleyin ve gece boyunca oda sıcaklığında çalkalayın. Çözeltinin dinlenmesine ve bir gün çökelmesine izin verin. Çökelme olmazsa, az miktarda sodyum asetat eklemeye devam edin. Çözeltiyi bir cam şişede saklayın.
- Kromojen Reaktifi: 1 mL kromojen reaktifi hazırlamak için, 500 μL deiyonize suya ve 10 μL konsantre (0) tiyoglikolik aside 1 mg 4,7-difenil-1,10-fenantrolin disülfonik asit disodyum tuzu ekleyin ve iyice çözün. Deiyonize su ile son hacmi 1 mL'ye kadar tamamlayın.
not: Gerektiği kadar kromojen reaktifi hazırlayın. Çözelti ışıktan korunduğunda 1 ay stabildir.
- Çalışan Kromojen Reaktifi (WCR): 5 hacim doymuş sodyum asetat ve 5 hacim deiyonize suya 1 hacim Kromojen Reaktif ekleyin.
not: Bu çözelti kullanım gününde taze olarak hazırlanmalıdır.
- Stok Demir Standart Çözeltisi: 20 mM'lik bir stok demir çözeltisi hazırlamak için, 5.480 μL 7 hidroklorik asit içeren 250 mL'lik hacimsel bir şişeye 111,5 mg karbonil demir tozu koyun. Gece boyunca oda sıcaklığında çözünmeye bırakın (veya kaynar su banyosunda inkübe edin). Ardından, çözeltiyi deiyonize su ile 100 mL'lik son hacme kadar hazırlayın.
not: Standart çözelti, sıkıca kapatılmış bir kapta saklandığında süresiz olarak saklanabilir.
- Çalışma Demir Standart Çözeltisi (WISS): 500 μL deiyonize suya 13,5 μL 7 hidroklorik asit ekleyin. 10 μL Stok Demir Standart Çözeltisi ekleyin ve son hacmi deiyonize su ile 1 mL'ye oluşturun (11.169 μg Fe / mL, 200 μM; AAS ile ölçülür).
not: Çalışma solüsyonu kullanım gününde taze olarak hazırlanmalıdır.
2. Numune kurutma
- Bir neşter bıçağı ile 10-100 mg ağırlığında bir doku örneği kesin. Analitik/hassas bir terazide küçük bir parafilm parçası (Taze Ağırlık) üzerinde doğru bir şekilde tartın.
- Plastik cımbız kullanarak, doku parçasını 24 oyuklu bir plakaya (suyun buharlaşmasına izin vermek için kapaksız) yerleştirin ve standart bir inkübatörde 65 ° C'de 48 saat kurumaya bırakın.
- Alternatif olarak, doku örneklerini kurutmak için bir laboratuvar mikrodalga sindirim fırını kullanın. Plastik cımbız kullanarak, tartılan doku parçasını demir içermeyen bir Teflon bardağa koyun ve mikrodalgada kurutun. Çalışma parametrelerini cihazın kullanım kılavuzuna göre ayarlayın.
not: Referans olarak, özel çürütme fırını kullanılarak karaciğer numunelerinin kurutulması için çalışma parametreleri (Malzeme Tablosuna bakınız) Tablo 1'de gösterilmiştir.
- Plastik cımbız kullanarak, kurumuş her bir doku parçasını analitik/hassas terazinin içindeki küçük bir parafilm parçasının üzerine yerleştirin ve doğru şekilde tartın (Kuru Ağırlık).
3. Örnek asidik sindirim
- Plastik cımbız kullanarak, kurutulmuş her doku parçasını 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- 1 mL asit karışımı ekleyin ve mikrosantrifüj tüpünü kapatın. Dokunun atlanması dışında aynı şekilde bir asit boşluğu hazırlayın.
Dikkat: Asit karışımı aşındırıcıdır ve toksik buharlar açığa çıkarır. Asit karışımını tutarken koruyucu giysiler, kimyasallara dayanıklı eldivenler ve kimyasal sıçrama gözlükleri kullanın. Solumaktan kaçının ve her zaman çeker ocak altındayken tutun.
- Mikrosantrifüj tüplerini bir inkübatörde 65 ° C'de 20 saat inkübe ederek dokuları sindirin.
- Oda sıcaklığına soğuduktan sonra, 500 μL berrak (sarı) asit ekstraktını (süpernatant) plastik uçlarla donatılmış bir mikropipet kullanarak yeni bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Berrak bir süpernatan elde etmek mümkün değilse, kısa bir santrifüj dönüşü gerçekleştirin.
Dikkat: Süpernatan oldukça asidiktir. Süpernatanları tutarken koruyucu giysiler, kimyasallara dayanıklı eldivenler ve kimyasal sıçrama gözlükleri kullanın. Bunları her zaman çeker ocak altındayken tutun.
not: Bu noktada, asit ekstraktları kolorimetrik test için hemen kullanılabilir veya daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C'de dondurulabilir. Dondurulmuş numuneleri oda sıcaklığına kadar tamamen çözün ve kullanmadan önce girdaplayın.
4. Renk geliştirme
- Kromojen reaksiyonlarını Tablo 2'de belirtildiği gibi 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde veya daha yüksek verim için doğrudan düz tabanlı, 96 oyuklu, berrak, işlenmemiş polistiren mikroplakalara hazırlayın. Tüm reaksiyonları (asit boş, standart ve numune) en az iki kopya halinde hazırlayın.
- Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
5. Absorbans okuması
- Deiyonize su referansına karşı 535 nm dalga boyunda bir spektrofotometrede veya plaka okuyucuda numune absorbansını ölçün. Plakalar kapaksız veya kapaklı olarak okunabilir. Kapaklı durumda, absorbans okumasında olası paraziti önlemek için ölçümden hemen önce kapaktan asit buharlarının salınması nedeniyle oluşan yoğuşmayı giderin.
not: Deiyonize suya (referans) karşı okunan asit körünün optik absorbansı 0.015'ten az olmalıdır; Standardın ve numunelerin optik absorbansı 0.100 ile 1.000 arasında olmalıdır. Çok yüksek veya çok düşük demir içeriğine sahip numuneler için, asit ekstraktı (süpernatant) ve diH2O hacimlerinin ayarlanması gerekebilir (Tablo 2): absorbans 1.0'dan büyükse, daha küçük bir numune (süpernatant) hacmi kullanın; Absorbans 0.1'den düşük olduğunda, daha yüksek bir süpernatan hacmi kullanın. Her bir numunenin doku demir içeriği hesaplanırken numune hacmi (Vsmp) dikkate alınır (bkz. adım 6).
6. Doku demir içeriğinin hesaplanması
- Aşağıdaki denklemle hem olmayan doku demir içeriğini hesaplayın:
Doku demiri (μg/g kuru doku) = Denklem 1
AT = test numunesinin absorbansı
AB = asit boş
emilimi
AS = standart
absorbansı
Fes = WISS'in demir konsantrasyonu (μg Fe/mL)
W = kuru doku ağırlığı (g)
Vsmp = numune hacmi (Tablo 2'deki değişken Süpernatan hacmi mL'ye dönüştürülür)
Vf = 65 °C'de gece boyunca inkübasyondan sonra asit karışımının nihai hacmi (asit hacmi artı mL cinsinden kuru doku hacmine karşılık gelir; numune ağırlıkları önemli ölçüde farklılık göstermiyorsa, sabit bir hacim ≈ 1 mL olduğunu varsayın)
Vstd = demir standart hacmi (Tablo 2'deki WISS hacmi mL'ye dönüştürülür)
Vrv = son reaksiyon hacmi (Tablo 2'deki toplam hacim mL'ye dönüştürülür)
Tablo 1: Burada kullanılan mikrodalga çürütme fırınında karaciğer kurutma için çalışma parametreleri
| Güç 650W (%): | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 |
| Basınç (PSI): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Zaman (dk): | 10 | 15 | 30 | 30 | 40 |
| Basınçta geçen süre (TAP): | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| vantilatör: | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
Tablo 2: 1.5 mL tüplerde veya 96 oyuklu plakalarda kromojen reaksiyonlarının hazırlanması.
adet
adet
adet
| | WCR (μL) | Asit karışımı (μL) | Süpernatan (μL) | WISS (μL) | diH2O (μL) | Toplam hacim (μL) |
| 1.5 mL tüpler | Asit Boş | 1000 | 150 | | | 150 | 1300 |
| standart | 1000 | 150 | | 150 | | 1300 |
| örnek | 1000 | | değişken | | değişken | 1300 |
| 96 oyuklu mikroplaka | Asit Boş | 150 | 22,5 | | | 22,5 | 195 |
| standart | 150 | 22,5 | | 22,5 | | 195 |
| örnek | 150 | | değişken | | değişken | 195 |