$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. OC öncüllerinin genişlemesi
- PBMC'leri 20 ng/mL M-CSF içeren tam α-MEM'de (%10 FBS, %1 Pen/Strep, %1 amfoterisin B) yeniden süspansiyon haline getirin. 2,5 x 105 hücre/cm2 yoğunlukta tohum PBMC'leri. Genellikle, 15-20 mL taze kandan izole edilen hücreler, 75cm2'lik bir şişeye (1.5-2 x 107 hücre) ekilebilir.
- Hücreleri, bağlı hücreler istenen bir birleşmeye ulaşana kadar her üç günde bir 20 ng / mL M-CSF içeren taze tam α-MEM ile besleyin. Tipik verimler, hücreler% 95 birleşim olduğunda 1.5-2 x106 hücre / şişedir. Genellikle genişleme süresi 6 gün sürer.
not: Öncülerin ostoklastojenik potansiyeli, uzun süreli yetiştirme süresi ile azalabilir.
2. Kalsiyum fosfat kaplı plakalarda osteoklasogenezin indüksiyonu
- Hücre yapışmasını kolaylaştırmak için, kalsiyum fosfat (CaP) kaplı plakaları 37 ° C'lik bir inkübatörde 1 saat boyunca 50 μL FBS ile inkübe edin.
- OC öncüllerini ayırmak için, ölü veya yapışık olmayan hücreleri çıkarmak için şişeyi PBS ile iki kez yıkayın. 30 dakika boyunca 75 cm2 şişe başına 4 mL tripsin (Malzeme Tablosu) ekleyin.
- Sindirimi durdurmak için 4 mL tam α-MEM ekleyin, bir hücre kazıyıcı kullanarak hücreleri dikkatlice ayırın ve hücreleri 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Bir Neubauer odası veya benzerini kullanarak toplam hücre sayısını belirleyin.
- Hücreleri 350 x g'da 7 dakika santrifüjleme ile peletleyin. 1 x 10 6 hücre / mL'lik bir konsantrasyon elde etmek için peleti 20 ng / mL M-CSF ve 20 ng / mL RANKL içeren yeterli tam α-MEM içinde yeniden süspanse edin.
- CaP kaplı 96 oyuklu plakadan FBS çözeltisini aspire edin ve kuyucuk başına 200 μL hücre süspansiyonu pipetleyin (2 x 105 hücre / oyuk).
- OC öncüllerini istenen süre boyunca veya deney tasarımıyla ilgili istenen reaktiflerle inkübe edin. Genellikle, yüksek sayıda büyük ve çok çekirdekli OK'ler 6 gün sonra ve rezorpsiyon çukurları oluştuğunda gözlenebilir. Her üç günde bir 20 ng/mL M-CSF ve 20 ng/mL RANKL içeren taze tam α-MEM ortamı ile hücreleri besleyin.
- İnkübasyonun sonunda, hücreleri PBS ile iki kez yıkayın, 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin ve tekrar PBS ile yıkayın.
- Sabit OC'leri doğrudan floresan boyama için kullanın veya 4 °C'de saklayın.
3. OC'lerin floresan boyanması ve kalsiyum fosfat kaplama
- Sabit hücreleri geçirgenlik tamponu (PBS'de% 0.1 Triton) ile 5 dakika inkübe edin.
- Aktin filamentlerini PBS'de 100 μL AlexaFluor 546 etiketli phalloidin solüsyonu ile 30 dakika boyayın ve boyama solüsyonunu aspire edin. Çekirdekleri boyamak için 10 dakika boyunca 100 μL Hoechst 33342 boyama solüsyonu (PBS'de 10 μg/mL) ekleyin. DAPI de kullanılabilir.
- CaP kaplamasını PBS'de 100 μL 10 μM kalsein ile 10 dakika boyunca boyayın. PBS ile üç kez yıkayın ve fotoğraf çekin.