Kültürlenmiş Hücrelerde Substrat Oksidasyon Deneyi: Hapsolmuş CO2'den Radyoaktif Sinyalleri Ölçerek Hücrelerde Substrat Oksidasyonunu Ölçmek İçin Bir İn Vitro Test

Özet

Kaynak: Song, C. et al., ¹⁴CO₂ Yakalama ile In Vitro Enerji Substrat Oksidasyonunun Değerlendirilmesi. J. Vis. Uzm. (2022)

Bu video, ¹⁴C-radyoaktif işaretli substrat kullanılarak substrat oksidasyonu sırasında salınan CO₂ için bir miktar belirleme tekniğini göstermektedir. Serbest bırakılan ¹⁴CO₂, alkali bir çözelti içinde tutulur ve bir sintilasyon sayacı ile ölçülür. Farklı substratların oksidasyonu dokular arasında değişir ve dokunun patofizyolojik durumunu yansıtır.

Protokol

Radyoaktif maddelerin (RAM) kullanımı, her kurumda belirlenmiş bir güvenlik komitesinin önceden onayını gerektirir.

1. ¹⁴adet C etiketli alt tabaka için stok çözeltilerinin hazırlanması

1. 11 g BSA ve 33.1 mL Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinini (DPBS) karıştırarak ve BSA tamamen eriyene kadar ~ 3 saat oda sıcaklığında hafifçe çalkalayarak 4 mM sığır serum albümini (BSA) stok çözeltisi yapın. Kullanmadan önce BSA stok çözeltisini 70 °C'lik bir su banyosunda ısıtın.
2. 50 μCi ¹⁴C-oleat (etanol içinde 50 μCi/μmol), belirlenmiş bir RAM çalışma davlumbazında kapak kapalıyken şişede havayla kurutun. 312.5 μL H₂O ve ardından 3.5 mg (11.5 μmol) sodyum oleat ekleyin. İyice karıştırın.
3. Elde edilen çözeltiyi bir su banyosunda 70 ° C'ye ısıtın. 0.9375 mM sıcak oleat stok çözeltisi elde etmek için önceden ısıtılmış 10 mL BSA stok çözeltisi ekleyin (14 C-oleate ila etiketlenmemiş oleat oranı 1^{: 11.5}içeren). Stok solüsyonunu alın ve uzun süreli kullanım için -20 °C'de saklayın.
4. Çözüldükten hemen sonra ¹⁴C-glikoz ve ¹⁴C-glutamin kullanın.

2. ¹⁴C etiketli substrat içeren ortamın hazırlanması

>NOT: Ortamdaki enerji substratlarının güvenilir konsantrasyonlarını sağlamak için, kullanımdan kısa bir süre önce eklenen yeni substratlarla birlikte özel yapım ortamlar kullanılmalıdır. Burada glikoz, piruvat, glutamin, fenol kırmızısı veya sodyum bikarbonat içermeyen özel yapım bir Minimum Temel Ortam (MEMα) kullanılır. Bununla birlikte, her hücre tipi için en uygun ortam belirlenmelidir.

1. 8.67 g orta tozu 1 L arıtılmış suda sulandırın. 7,4 pH'a ulaşmak için 2,2 g sodyum bikarbonat ekleyin ve çözeltiyi 0,22 μm vakum filtrasyonu kullanarak süzün.
2. Nihai konsantrasyonları 5.5 mM glikoz, 2 mM glutamin, 1 mM piruvat ve %10 fetal sığır serumu (FBS) ile tam ortamı (cMEMα) elde etmek için taze malzemeler ekleyin. Yağ asidi oksidasyonunu kolaylaştırmak için cMEMα'yı 100 mM L-karnitin ve 10 μM HEPES ile daha fazla destekleyin.
3. Kullanmadan hemen önce, sıcak ortam yapmak için taze hazırlanmış cMEMα'ya ¹⁴C etiketli alt tabaka ekleyin. Oleat sıcak ortamını yapmak için, 100 μM oleatın nihai konsantrasyonu (1:100 seyreltme, nihai radyoaktivite 0.4 μCi / mL) için 10 mM sıcak oleat stok çözeltisini cMEMα'ya ekleyin.
   not: 1: 11.5 oranında sıcak: soğuk oleat içeren 10 mM sıcak oleat stoğu (bkz. adım 1.3), radyoaktif madde miktarını en aza indirirken ortamda toplam 100 μM fizyolojik bir oleat seviyesi elde etmek için kullanılır.
2
4. mL H₂O'ya 24.36 mg sodyum oleat ekleyerek 10 mM etiketlenmemiş oleat stoğu yapın 70 ° C'de bir su banyosunda ~ 20 dakika boyunca tamamen eriyene kadar 6 mL 4 mM BSA stok çözeltisi ile hızlı bir şekilde karıştırın 70 ° C'ye önceden ısıtılmış 70 ° C'lik bir su çözeltisi. 1 saat boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna aktarın ve 0.22 μm'lik bir filtreden süzün. Uzun süreli kullanım için -20 °C'de saklayın ve saklayın.
5. Glikozu sıcak ortam yapmak için, 1.333 μM'lik (1: 4.125 seyreltme, son radyoaktivite 0.4 μCi / mL) nihai konsantrasyona ¹⁴C-glikoz ekleyin. Glutamini sıcak ortam yapmak için, 2 μM'lik (1: 1.000 seyreltme, nihai radyoaktivite 0.4 μCi / mL) nihai konsantrasyona ¹⁴C-glutamin ekleyin.
6. Oleat sıcak ortamdakiyle aynı olan 100 μM oleatın nihai konsantrasyonunu elde etmek için glikoz ve glutamin sıcak ortamını, adım 2.4'ten 10 mM'lik bir etiketlenmemiş oleat stok çözeltisi ile destekleyin.

3. Hücrelerin hazırlanması

>NOT: Kalvarial preosteoblastlar ve kemik iliği makrofajları burada örnek olarak kullanılmıştır. Kullanıcılar seçtikleri hücre tipini uygun protokollere göre hazırlamalıdır. Enzimatik aktivite farklı lotlar arasında değişebileceğinden, pilot deneylerde sindirim için kullanılacak kollajenaz II konsantrasyonunu optimize edin.

1. Kalvarial preosteoblastların izolasyonu ve kültürü
   1. Doğum sonrası 3-5. gün (P3-5) yavruları dekapitasyon ile kurban edin ve Penisilin-Streptomisin (P/S) içeren buz gibi DPBS'ye aktarın.
   2. Cildi ve yumuşak dokuyu çıkararak kalvaria'yı ortaya çıkarın. DPBS'de çevre dokuları arkadan öne doğru keserek orta bölgeyi toplayın (Şekil 1A). Calvaria'nın iç ve dış yüzeylerini, sonraki sindirimden sonra hücrelerin serbest kalmasına yardımcı olmak için cımbız kullanarak nazikçe çizin.
   3. DPBS'de 2 mg / mL ve 4 mg / mL Kollajenaz tip II çözeltisi hazırlayın ve her çözeltiyi 0.22 μm'lik taze bir filtre ile filtreleyin. Temizlenmiş kalvariaları önce 2 mg / mL kollajenaz solüsyonu ile 15 dakika sindirim ve sindirim solüsyonunu atın. Temizlenmiş numuneleri 4 mg / mL kollajenaz çözeltisi içinde her seferinde 15 dakika boyunca 3 kez sindirin, sindirim çözeltisini bir araya getirin ve saklayın.
   4. Sindirim çözeltisini 70 μm hücre süzgeçlerinden süzün ve süzüntüyü 300 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Hücre peletini %10 FBS ve P/S içeren cMEMα içinde (bkz. adım 2.2) yeniden süspanse edin.
   5. Hücreleri 10 cm'lik plakalarda 4 ×^{10 4} hücre /^cm2'de sayın ve tohumlayın. Hücreleri 37 ° C'lik bir inkübatörde 3 gün boyunca% 5 CO₂ ile kültürleyin.
   6. Hücreleri 37 ° C'de% 0.25 tripsin-EDTA ile ayırın. 7.5 × 10⁵ /^cm2'de% 10 FBS ve P / S içeren% 10 FBS ve P / S içeren 24 oyuklu hücre kültürü plakalarındaki hücreleri sayın ve tohumlayın. Testten önce hücre sayımı için substrat başına hücre tipi başına en az 4 kuyucuk ve her hücre tipi için en az üç ekstra kuyu tohumlayın.
   7. Substrat oksidasyon testlerinden önce hücreleri gece boyunca 37 ° C'de kültürleyin.
2. BMM'lerin izolasyonu ve kültürü
   NOT: BMM'lerin kültürü, ticari olarak rekombinant bir protein olarak satın alınabilen makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) gerektirir. M-CSF'yi ifade etmek için tasarlanmış CMG14-12 hücre hattından şartlandırılmış ortam, burada kullanılan ekonomik bir alternatiftir.
   1. Kas ve bağ dokularını çıkardıktan sonra 8 haftalık farelerden femur ve tibiaları toplayın. Kemiklerin her iki ucunu keskin bir makasla kesin ve atın.
   2. Kemik iliğini bir uyluk kemiği ve bir tibiadan 10 cm'lik bir Petri kabına% 10 FBS, P / S ve% 10 CMG14-12 koşullu ortam (BMM ortamı) ile 15 mL cMEMα içeren 23 G'lik bir iğne ile donatılmış bir şırınga ile yıkayın. Petri kabındaki hücreleri 37 °C'lik bir inkübatörde %5 CO₂ ile kültürleyin.
   3. 3 gün sonra kültür ortamını atın ve DPBS ile durulayın. Bağlı hücreleri 37 ° C'de% 0.25 tripsin-EDTA ile 5 dakika ayırın. Hücre peletini BMM ortamında santrifüjleyin ve yeniden süspanse edin.
   4. 24 oyuklu hücre kültürü plakalarındaki hücreleri, 3.1.6'da açıklandığı gibi 7.5 × 10⁵ /^cm2'de sayın ve tohumlayın. Tahlillere başlamadan önce BMM ortamında gece boyunca 37 ° C'de kültürleyin.

4. CO₂ tuzağı ile substrat oksidasyon deneyi

>NOT: Testin başlamasından önce %80-90 birleşme elde etmek için her hücre tipi için uygun bir tohumlama yoğunluğu belirlenmelidir. Hücre yoğunluğunun hücrelerin metabolik durumunu etkileyebileceğini unutmayın.

1. Ekstra kuyucuklardaki hücreleri DPBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri% 0.25 tripsin-EDTA ile ayırın ve DPBS'de yeniden süspanse edilen 20 μL hücreleri 20 μL akridin portakal / propidyum iyodür (AO / PI) kullanıma hazır ticari boya çözeltisi ile karıştırın. Otomatik bir hücre sayacı ile canlı hücrelerin sayısını belirleyin ve son hesaplamalar için sayıyı kaydedin.
2. Tahlil kuyucuklarındaki hücreleri DPBS ile iki kez yıkayın. RAM tarafından belirlenen doku kültürü başlığında her bir tahlil kuyusuna 500 μL sıcak ortam ekleyin. Plakaları parafilm ile kapatın ve hücreleri RAM tarafından belirlenmiş bir inkübatörde 37 ° C'de 4 saat inkübe edin.
3. İnkübasyon sırasında, filtre kağıdını 1,5 ml'lik mikrosantrifüj tüplerinin kapağının içindeki alandan biraz daha büyük dairesel parçalar halinde kesin ve kağıdı kapağın içine sıkıca yerleştirin (Şekil 1B). Her tüpe 200 μL 1 M perklorik asit ve kapağın içine takılan filtre kağıdına 20 μL sodyum hidroksit ekleyin.
4. Hücrelerin inkübe edilmesinden sonra, her bir oyuktan 400 μL kültür ortamını hazırlanan tüplere aktarın ve kapakları hemen kapatın. Tüpleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca bir tüp rafında bırakın.
5. Kuluçka sırasında, her tüp için bir sintilasyon şişesi hazırlayın ve 4 mL sintilasyon sıvısı ile doldurun. Her bir filtre kağıdı parçasını bir parıldama şişesine aktarın ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.
6. Doku kültürü başlığı, su banyosu (¹⁴C-oleat hazırlığı için kullanılır), buzdolabı, inkübatör, lavabo, zemin ve olası RAM kontaminasyonu için diğer çalışma alanlarında silme testleri yapın. Kağıt mendilleri sintilasyon sıvısı içeren parıldama şişelerine koyun.
7. Bir sintilasyon sayacı ile sintilasyon şişelerindeki ¹⁴C radyoaktiviteyi ölçün. Okuma sonuçlarını kaydedin. Gerekirse çalışma ortamını radyasyon güvenliği yönergelerine göre dekontamine edin.

Sonuçlar

Şekil 1: CO₂ yakalama testi ve kalvaria diseksiyonu için diyagramlar. (A) Turuncu kesikli üçgen ile gösterilen kalvaria'nın orta bölgesi, hücre izolasyonu için hasat edilir. (B) CO₂ yakalama için 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri kullanılır (adım 1). Filtre kağıtları (örnekleme amaçlı mavi kağıt) tüp kapaklarına sığacak şekilde kesilir (2. adım). Kap...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0,22 μm filtreler	Sigma-Aldrich	SLGVM33RS	BSA çözümünü filtrelemek için kullanılır
% 0.25 Tripsin-EDTA	Gibco (Gibco)	25200056	Hücreleri hücre kültüründen ayırın Plaka
1,5 mL Eppendorf tüpleri	PR1MA	Halkla İlişkiler MCT17 RB	Reaksiyon inkübasyonu için kullanılır
10 cm'lik plakalar	TPP (Cesaret Partisi	93100	Hücre kültürü için kullanılır
10 mL şırınga	Bd	302995	Uzun kemikler
%10 FBS	Atlanta biyolojisi	S11550 Serisi	Hücre kültürü ortamı hazırlığı için
14C -Glikoz	PerkinElmer	NEC042X050UC	Sıcak medya yapmak için kullanılır
14 C-glutamin	PerkinElmer	NEC451050UC	Sıcak medya yapmak için kullanılır
14 C-oleat	PerkinElmer	NEC317050UC	Sıcak medya yapmak için kullanılır
23 G iğne	Bd	305120	Uzun kemikler
24 oyuklu plakalar	TPP (Cesaret Partisi	92024	Hücre kültürü için kullanılır
70 μm hücre süzgeçleri	MIDSCI (ORTA BILIM)	70 HÜCRELİ	Süpernatanı Kavarial Sindirim
Akridin Portakal / Propidyum İyodür < br / > (AO/PI) boya	Nexcelom Biyolojik Bilimler	CS2-0106	Tohum belirlemek için canlı hücreleri boyar yoğunluk
Sığır Serumu Ablumin	Proliant Biyolojikler	68700	Yağ asidi konjugasyonu için kullanılır
Cellometer Auto 2000	Nexcelom Biyolojik Bilimler		Canlı hücrelerin sayısını belirleyin
merkezkaç	Termo Balıkçı	Efsane Mikro 21R	Hücreleri peletlemek için kullanılır
Kollajenaz tip II	Worthington	LS004176	Hücreleri dokudan ayırın
Özel MEM alfa	GIBCO Bilişim Teknolojileri	Ürün Kodu: ME 18459P1	Özel sıcak medya oluşturmak için kullanılır
Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzlu	Gibco (Gibco)	10010023	Reaktifleri çözmek ve seyreltmek için kullanılır, ve kültür bulaşıklarını yıkayın
Filtre Kağıdı	Millipore-Sigma	WHA1001090	CO 2'yi sodyum hidroksit ile tuzaklar
glikoz	Sigma-Aldrich	G7528	Özel medya yapmak için kullanılır
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Gibco (Gibco)	15630080	Hücre kültürü sırasında CO 2'yi yakalar
L-karnitin	Sigma-Aldrich	C0283	Yağ asidi oksidasyonu için takviye edilmiştir
L-Glutamin	Sigma-Aldrich	G3126	Özel medya yapmak için kullanılır
MEM alfa	Termo	A10490	Hücre kültürü ortamı
Parafilm Filmi	Pecheney Plastik Ambalaj	PM998	Hücre kültürü kaplarını kapatmak için kullanılır
Penisilin-Streptomisin	Termo Balıkçı	15140122	Hücre kültüründe kontaminasyonu önler
Perklorik Asit	Sigma-Aldrich	244252	Metabolik sırasında CO 2 salgılar Tahlil
Piruvat	Sigma-Aldrich	P5280	Özel medya yapmak için kullanılır
Sintilasyon Sayacı	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	LS6500	Radyoaktiviteyi belirler Filtre kağıdı
Sintilasyon Sıvısı	MP Biyomedikal	882453	RAM'lerin yaydığı enerjiyi absorbe ve ışık çakması olarak yeniden yayar
Sintilasyon Şişesi	Balıkçı Bilimsel	03-337-1	Sintilasyon için reaksiyon kapları akışkan
Sodyum karbonat	Sigma-Aldrich	S5761 Serisi	Orta için denge tamponu
Sodyum Hidroksit	Sigma-Aldrich	58045	Metaboilc testi sırasında CO2'yi yakalar
Sodyum oleat	SANTA CRUZ	SC-215879	BSA konjuge yağ asidi hazırlık
Vakum filtrasyonu 1000	TPP (Cesaret Partisi	99950	Filtre cMEMα

Gazetesi adet Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Gazetesi Serisi Serisi Serisi Gazetesi Gazetesi Serisi Serisi Gazetesi Gazetesi Serisi