$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir
.
1. Mavi ışık aydınlatması için LED'in hazırlanması
- Bir tablete/telefona yüklenen ilgili uygulamayı kullanarak bir LED paneli açın. Bir spektrometrenin probunu 6 oyuklu bir çanağın boş bir kuyusuna koyun ve LED ışığını uygulama boyunca ~ 456 nm'de zirve yapan dalga boyuna ayarlayın. Bir optik güç ölçerin optik sensörünü boş kuyuya yerleştirin ve LED ışığının gücünü ayarlayın (~0.61 mW/cm2). LED ışık ayarı kaydedilebilir ve uygulamada geri alınabilir.
- Çanak/LED panel ayarını 28 °C'de inkübatöre tanıtın. Balıkların görüntülenmesi 48 hpf'de başlamadan önce bu adımı tamamlayın.
2. Optogenetik TDP-43 eksprese eden zebra balığı larvalarının görüntülenmesi
- Plan-Neofluar 5x/0.15 objektif lens ile donatılmış epifloresan mikroskobu kullanılarak spinal motor kolonunda RFP (opTDP-43h) veya EGFP (EGFP-TDP-43z) floresansına dayalı olarak RFP (opTDP-43h:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] çift transgenik balığı en az 47 hpf'den önce seçin.
- Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] çift transgenik balığın dekoryonunu dekoryonlayın.
- 42 °C'de 250 μg/mL etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu içeren %1 düşük erime sıcaklığına sahip agarozu önceden ısıtın.
- Aynı konsantrasyonda Trikan içeren E3 tamponunda Tg [mnr2b-hs: opTDP-43h] Tg [mnr2b-hs: EGFP-TDP-43] çift transgenik balığı kısaca anestezize edin.
- Önceden ısıtılmış %1 düşük erime sıcaklığındaki agarozdan bir damla oda sıcaklığında cam taban kabına koyun. Cam tabak üzerindeki kubbe şeklindeki agaroz damlasının çapı 8-10 mm'dir.
- Bir Pasteur pipeti kullanarak, uyuşturulmuş balığı cam taban kabı üzerindeki düşük erime sıcaklığındaki agaroza ekleyin ve ardından birkaç kez pipetleyerek karıştırın. Balıkla birlikte agaroza eklenen E3 tamponunun miktarını en aza indirin.
- Omuriliğin uygun bir yatay pozisyonda olduğundan emin olmak için agarozun katılaşması sırasında (tipik olarak ~ 1 dakika) bir şırınga iğnesi kullanarak balığı yan tarafında tutun. Katılaşmadan sonra, kubbe şeklindeki agaroza monte edilmiş balığın üzerine birkaç damla E3 tamponu koyun.
- Piksel başına 4,0 μs (piksel başına 12 bit) tarama hızı kullanarak, sayısal açıklığı 1,00 olan 20x suya daldırma objektif lensi ile donatılmış bir konfokal mikroskopla tarayarak omuriliğin seri konfokal z kesitlerini elde edin, objektif için dilim başına 1,0 μm'lik bir adım boyutu ve uyarma/emisyon dalga boylarının bir kombinasyonu: Kanal 1) EGFP için 473/510 nm ve Kanal 2) mRFP1.
için 559/583 nm
not: Balığın ventral tarafındaki kloak, referans olarak ilgi alanlarına (ROI) dahil edilir, bu da omurga segmentlerini (seviye 16-17) zaman noktaları boyunca tanımlamaya ve karşılaştırmaya yardımcı olur.
- Görüntüleme tamamlanır tamamlanmaz agarozu bir şırınga iğnesi ile dikkatlice kırarak balığı agarozdan çıkarın. Balığın agaroza gömülme süresini mümkün olduğunca kısa tutun, ancak agarozun <30 dakika gömülmesi balığın canlılığını etkilemez.
3. Mavi ışık yayan diyot (LED) ışığının alan aydınlatması ile opTDP-43h ifade eden balığın ışık stimülasyonu
- Kuyuya 7,5 mL E3 tamponu ekleyin ve görüntülenen Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] çift transgenik balığı kuyuya yerleştirin. Altı kuyulu çanağı, çanağı ve LED paneli bir ara parça ile 5 mm aralıklı tutarak (örneğin, beş sürgülü cam üst üste konulmuş olarak) LED panelin üzerine yerleştirin.
- Mavi LED ışığını açın. Tg[mnr2b-hs:opTDP-43h] Tg[mnr2b-hs:EGFP-TDP-43z] çift transgenik balıkların bir kısmını, ışıksız kontrol balıklarının gerekli olduğu durumlarda (yani karanlık koşullarda) alüminyum folyo ile kaplı altı oyuklu ayrı bir tabakta saklayın.
- Aydınlatmadan sonra (örneğin, Şekil 1'de 72 hpf'de 24 saat boyunca), 2.3 - 2.9 adımlarını tekrarlayarak aydınlatılan balığın omuriliğini görüntüleyin.
