Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir
.
1. İn vitro küçük molekül ekranı
- Aşağıdaki adımları izleyerek tahlil plakalarını hazırlayın.
- Otoklavlanmış damıtılmış suyu steril bir oluğa dökün ve çok kanallı bir pipet kullanarak, oluktan 40 μL damıtılmış suyu düz tabanlı 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna dağıtın.
- Sabitleme aletini hazırlayın ve kimyasalları ekleyin.
- Pinner tepsilerini kurun (Malzeme Tablosuna bakın) bir laboratuvar tezgahında bir Bunsen brülör alevinin yakınına. Ardışık pinner tepsilerine aşağıdakileri ekleyin: 25 mL pim temizleme solüsyonu, 35 mL %50 DMSO (suda), 45 mL damıtılmış su, 55 mL %70 EtOH ve 65 mL %95 EtOH. Her tepsinin önüne bir parça kurutma kağıdı yerleştirin.
- Pimleri temizleme solüsyonuna batırarak ve pimleri solüsyon içinde üç kez (3x) yukarı ve aşağı hareket ettirerek sabitleme aletini temizleyin. Bu protokolde, '3x' ve '10x', pinner'ı bir çözelti içinde sırasıyla üç veya on kez yukarı ve aşağı hareket ettirmek olarak tanımlanır. Kurutma kağıdının üzerindeki pimleri kurulayın. Bu işlemi bir kez daha tekrarlayın.
- Ardından, pimleri 3x damıtılmış suda durulayın ve ardından pimleri kurulayın. İşlemi bir kez daha tekrarlayın.
- Son olarak, pimleri %95 EtOH'de 3x durulayın ve ardından pimleri kurulayın. Bir kez daha tekrarlayın. Pinker'ı alevlendirin ve etanolün buharlaşmasına izin verin.
- 96 oyuklu kimyasal stok plakalarından kimyasalları, 3x'i kimyasal plakaya sabitleyerek ve ardından pimleri 10X'i tahlil plakasına aktararak tahlil plakalarına ekleyin. Temizleme solüsyonunun önündeki kağıda kurulayın.
- Plakalar arasındaki sabitleme aletini aşağıdaki sırayla yıkayarak temizleyin, arada kurutma kağıdına kurulayın: %50 DMSO'da 3x (bir kez), damıtılmış suda 3x (bir kez), %75 EtOH'de 3 kat (bir kez), %95 EtOH'de 3 kez (iki kez). Pinker'ı alev alın ve etanolün buharlaşmasına izin verin.
- Tüm sabitleme tamamlandığında 1.2.2 adımını tekrarlayın.
not: Tarama, 60 μM'lik bir son konsantrasyonda gerçekleştirildi.
- Solucanların eklenmesi
- Gözlem için bir slayt üzerine düşük tutma uçları kullanarak 5 μL'yi önce yeniden askıya alarak ve ardından pipetleyerek koleksiyondaki nematod sayısını sayın. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak 5 μL'deki nematod sayısını sayın.
- Steril damıtılmış su kullanarak konsantrasyonu 2 solucan / μL'ye ayarlayın. Çok kanallı bir pipet ve bir oluk kullanarak, 96 oyuklu plakaların her birine 10 μL (~ 20 solucan) ekleyin.
not: Yaklaşık 15.000 D. dipsaci nematodları, tarif edilen kültür ve toplama yöntemi kullanılarak kültür plakası başına toplanacaktır. Kuyu başına yirmi solucan kullanılır, çünkü küçük sayı, hareketli ve hareketsiz olanların net bir şekilde görselleştirilmesini ve muhasebeleştirilmesini kolaylaştırır.
- Plakaları laboratuvar sarma filmine kapatın ve nemli bir kağıt havluyla sarın. Kutuya yerleştirin ve 200 rpm'ye ayarlanmış 20 ° C çalkalama inkübatörde yapışkan bir ped üzerine yapıştırın. Plakaların minimum hareketini sağlamak için ekstra nemli bir kağıt havlu ekleyerek plakaların kutuda sabitlendiğinden emin olun.
2. Veri toplama ve analizi
- 5. günde diseksiyon mikroskobu altında plakaları gözlemleyin. DMSO çözücü kontrollerinde ve ilaçla tedavi edilmiş kuyucuklarda mobil ve toplam D. dipsaci sayısını sayın.
- Solucanlar nispeten hareketsizse, hareketi uyarmak için kuyuya 40 mM'lik bir nihai konsantrasyona 2 μL 1 M NaOH ekleyin.
not: NaOH eklendikten sonra, solucanlar anında hareket eder ve 5 dakika içinde görüntülenmesi gerekir. Mobil solucanların sayısı ve toplam solucan sayısı, mobil solucanların oranını hesaplamak için kullanılacaktır. Testin uzunluğu, ekranın amacına bağlı olarak değişebilir.
- Mobil solucanların oranını hesaplayın. D. dipsaci eleklerinde, tekrarlanabilir şekilde %0 mobil solucan veren kuyular güçlü isabetler olarak kategorize edilir.
not: Diseksiyon mikroskopları aşamasında plakaların uzun süre maruz kalması önlenir, çünkü ışık kaynağı plakaları ısıtabilir ve biyo-tahlil üzerinde değişken etkilere neden olabilir.
