İn Vitro Mineralizasyon Deneyi: Alizarin Red S Boyama ve Ekstraksiyonu ile Kemik Grefti İkamesi Üzerindeki Osteoblast Kalsiyum Birikintilerini Ölçmek İçin Kolorimetrik Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Kampleitner, C. et al. Kemik Rejenerasyonu için Biyomalzemeler Üzerinde Biyolojik Uyumluluk Profili. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu videoda, anyonik bir boya olan Alizarin Red S kullanılarak osteoblast tarafından salgılanan kalsiyum birikintilerinin tespiti için bir yöntem açıklıyoruz. Kültürlenmiş osteoblastlar önce boyanır ve daha sonra boya, kalsiyum birikintilerinin kolorimetrik miktar tayini veya osteoblast mineralizasyon derecesi için geri kazanılır.

Protokol

1. Osteoblast mineralizasyon testi

1. 14 mm çapında β-trikalsiyum fosfat (β-TCP) disklerini, osteoblastları eklemeden önce 37 ° C'de 24 oyuklu bir süspansiyon kültür plakasında 1 mL kemik büyüme ortamında (BGM) ve 24 saat boyunca% 5 CO₂ içinde önceden inkübe edin. Hücrenin plastiğe bağlanmasını önlemek için kontroller için standart doku kültürü plakaları ve biyomateryal numuneleri için süspansiyon kültürü plakaları kullanın.
2. Ön inkübasyon ortamını aspire edin ve ardından BGM'de birincil fare OB'lerini yeniden askıya alın. 8.8 x 10⁴ OBs/cm² 24 oyuklu bir süspansiyon kültür plakasında önceden inkübe edilmiş β-TCP disklerine ve kontrol grubu için 24 oyuklu bir doku kültürü plakasına (1 mL/oyuk) ekleyin. OB'ler doku kültürü plakasına veya biyomateryal numunesine yapışacaktır.
3. OB'lerin eklenmesinden 24 saat sonra BGM'yi, 50 μg/mL askorbik asit ve 5 mM β-gliserofosfat içeren 1 mL osteojenik mineralizasyon ortamı (MM) ile değiştirin ve 37 °C ve% 5 CO₂'de 14 gün inkübe edin. Ortamı her 2-3 günde bir, her bir oyuğa 1 mL taze hazırlanmış MM ile değiştirin.

2. Alizarin Red S (ARS) ile boyanarak değerlendirilen osteoblast mineralizasyonu

1. MM ilavesinden 14 gün sonra kültür ortamını birincil OB'leri içeren kuyucuklardan aspire edin ve RT'de 0.5 mL 1x PBS ile iki kez durulayın. PBS'yi aspire edin ve RT'de 10 dakika boyunca% 10 tamponlu formalin çözeltisinin 0.5 mL'sini ekleyerek hücreleri sabitleyin.
2. %10 tamponlu formalini tek kullanımlık bir pipetle aspire edin ve 0,5 mL ultra saf su ile iki kez yıkayın.
3. Sabit OB'lere, ultra saf suda çözülmüş 0.25 mL 40 mM ARS boyama çözeltisi (pH 4.2) ekleyin ve plakayı RT'de 10 dakika boyunca 100 çalkalayıcı / dk'da bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
4. Boyama solüsyonunu tek kullanımlık bir pipetle aspire edin ve 1 mL ultra saf su ile durulayın. Belirsiz lekelenmeyi gidermek için bu adımı 5-10 kez tekrarlayın.
   not: Durulama çözeltisi renksiz olmalıdır.
5. Ultra saf suyu aspire edin ve 1 mL soğuk PBS ekleyin. Plakayı RT'de 10 dakika boyunca 100 shake / dk'da bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
6. PBS'yi aspire edin, lekeli β-TCP diskleri yeni bir kuyuya aktarın ve mineralizasyonu kaydetmek için plakaları düz yataklı bir tarayıcı ile tarayın.
7. 0.25 mL% 10 setilpiridinyum klorür çözeltisi ekleyin ve ARS boyasını çıkarmak için plakayı RT'de 15 dakika boyunca 100 çalkalama / dk'da inkübe edin.
8. Süpernatanları 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın ve RT'de 5 dakika boyunca 17.000 x g'da santrifüjleyin.
9. 1:10–1:20 seyreltme oranına sahip ekstraktlara %10 setilpiridinyum klorür çözeltisi ekleyin ve numuneleri (300 μL) sadece %10 setilpiridinyum klorür içeren iki boş kuyu içeren 96 oyuklu bir plakaya ekleyin.
10. Standart bir eğri oluşturmak için 40 mM ARS boyama solüsyonunu (pH 4.2) %10 setilpiridinyum klorür solüsyonu ile seyrelterek 4 ila 400 μM arasında değişen 7 ARS referans standardı hazırlayın.
11. 300 oyuklu plakaya çift olarak 96 μL referans standardı ekleyin.
12. 520 nm'de numunelerin, işlenmemiş parçaların ve referans standartların absorbansını okuyun.
13. Boş okumaları referans standartlarından ve örnek okumalardan çıkarın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
β-trikalsiyum fosfat diskler (β-TCP, 14 mm)			Diskler, 1150 ° C'lik bir sıcaklıkta bir kül fırınında sinterlendi. Numuneler, hücre kültürlerinde kullanılmadan önce UV ışınlandı (her iki taraf için 15 dakika)
Alizarin Kırmızı S	Sigma-Aldrich	A5533
Kemik büyüme ortamı (BGM)			α-MEM +% 10 ısıyla inaktive edilmiş FBS +% 1 penisilin / streptomisin
Formalin çözeltisi nötr tamponlu %10	Sigma-Aldrich	HT501128
Hekzadesilpyrdinium (setilpiridinyum) klorür monohidrat	Sigma-Aldrich	C9002
L-Askorbik asit 2-fosfat seskimagnezyum tuzu hidrat	Sigma-Aldrich	A8960
MEM alfa ortamı (α-MEM)	Gibco Yaşam Teknolojileri	11900-073
Osteojenik mineralizasyon ortamı (MM)			α-MEM +% 10 ısıyla inaktive edilmiş FBS +% 1 penisilin-streptomisin + 50 μg / mL askorbik asit + 5 mM β-gliserofosfat
Penisilin-streptomisin	Sigma-Aldrich	P4333 Serisi
Fosfat tamponlu tuzlu su 1x (PBS) pH 7.4	Gibco, Termo Balıkçı Bilimsel	10010023
β-Gliserofosfat disodyum tuzu hidrat	Sigma-Aldrich	G5422
Ultra saf su: Hücre kültürü suyu pirojen içermez	VWR (VWR)	L0970-500
96 oyuklu şeffaf plaka	Greiner biyo-bir	655001
24 oyuklu süspansiyon kültür plakası	Greiner biyo-bir	662102
24 oyuklu doku kültürü plakası	Greiner biyo-bir	662160
Santrifüj: VWR Mega Star 600R	VWR (VWR)
CO2 İnkübatör: HeraCell 240	Termo Bilimsel
Düz yataklı tarayıcı: Epson Perfection 1200 Photo	Epson'un
Sonsuz M200 Pro mikroplaka okuyucu	Tecan
Mikrosantrifüj tüpü: Eppendorf tüpü güvenli kilit 1,5 mL	VWR (VWR)	21008-959
Çalkalama inkübatörü GFL3032	GFL (Cesaret Numarası	3032
Tek kullanımlık pipet: serum pipeti	Greiner biyo-bir	612301