Erken Evre Anjiyogenez Değerlendirmesi için Boncuk Filizlenme Testi: Perisitlerin Varlığında Endotelyal Filizlenmeyi İncelemek İçin İn Vitro Boncuk Tabanlı Bir Model

Özet

Kaynak: Azam, S. H. et al. Perisitlerin Endotel Hücre Boncuk Filizlenme Testine Dahil Edilmesi. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu video, anjiyogenezin erken aşamalarında endotel filizlenmesini incelemek için perisitleri içeren modifiye edilmiş bir mikro taşıyıcı boncuk bazlı testi göstermektedir. Test, anjiyogenezin moleküler mekanizmalarını ve anti-anjiyogenetik terapötiklerin etkisini anlamak için in vitro deneysel bir model sağlar.

Protokol

1. Jel İmplantasyonu için Boncukların Hazırlanması

1. İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücreleri (HUVEC) ve perisitlerle kaplanmış mikro taşıyıcı boncuklar içeren bir kültür alın.
2. Tüm boncukların endotel hücreleri tarafından yeterince kaplandığından emin olmak için 20X objektifini kullanarak mikro taşıyıcı kaplı boncukları içeren tabakları mikroskop altında inceleyin.
3. Hücrelerin kaplanmış çözeltisini 6 cm'lik plakadan ayırmak için kuvvetlice pipetleyin ve çözeltiyi bir tüpe yerleştirin. Plakayı tam ortamla 2 kat daha yıkayın ve plakaya yapışabilecek tüm artık boncukları toplamak için tüpe aktarın.
   1. Hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının ve endotel hücre kaplı boncuklar üzerindeki kayma stresini en aza indirmek için bir p1000 pipet kullanın.
4. Solüsyondaki boncukların tüpün dibine çökmesi için 3 dakika bekleyin.
5. Bir p1000 pipet ucu kullanarak boncuk peletini bozmadan mümkün olduğunca fazla süpernatanı çıkarın (vakum aspiratörü kullanmayın).
6. Her tüpe 1 mL tam ortam ekleyin ve boncukları yeniden süspanse edin.
7. Boncukların dibe çökmesi için 30-60 saniye bekleyin. Ardından, boncuk peletini bozmadan bir P1000 pipeti kullanarak mümkün olduğunca fazla süpernatanı çıkarın. Boncuk peletinin yanlışlıkla çıkarılması olasılığı büyük ölçüde arttığı için vakum aspiratörü kullanmayın.
8. Adım 1.6 ve 1.7'yi iki kez daha tekrarlayın. Amaç, 6 cm'lik plakadan ayrılmış olabilecek serbest yüzen HUVEC'in mümkün olduğunca çoğunu çıkarmak ve yuvarlak tabanlı Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) tüplerine serbest yüzen hücrelerden daha hızlı yerleşmesi gereken çok fazla HUVEC kaplı boncuk çıkarmamaktır.
9. Boncuklara 1 mL tam ortam ekleyin.

2. Kaplanmış boncukları bir fibrin jele gömmek

1. Bir P1000 pipeti kullanarak her bir FACS tüpündeki boncuk peletini bozmadan mümkün olduğunca fazla ortamı çıkarın.
2. Boncukları 2.5 mL fibrinojen çözeltisi içinde tekrar süspanse edin.
3. 24 oyuklu cam tabanlı bir plakanın istenen her bir kuyucuğuna 13 μL trombin solüsyonu pipetleyin. Filizlerin en iyi şekilde görüntülenmesini sağlamak için cam tabanlı bir plakada kaplama çok önemlidir.
   NOT: Bir sonraki adımdan önce trombini 5-10 dakikadan fazla bir kuyuda bırakmayın.
4. Her kuyucuğa 0.5 mL boncuk / fibrinojen çözeltisi ekleyin.
   1. Çözeltiyi her seferinde pipetlemeden önce boncuk çözeltisini iyice yeniden süspanse ettiğinizden emin olun.
   2. Kuyuda zaten mevcut olan trombine doğrudan dikkatlice pipetlemeye dikkat edin. Solüsyonu iyice karıştırmak için 2-3 kez yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyin ve hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin.
   3. Pipet ucunu kuyucuklar arasında değiştirdiğinizden emin olun.
   4. İlk fibrin pıhtılaşması sırasında herhangi bir noktada plakayı hareket ettirmemeye veya rahatsız etmemeye dikkat edin, çünkü herhangi bir hareket jel oluşumunu bozabilir.
5. Plakayı oda sıcaklığında 30 dakika davlumbazda bekletin.
6. Jedinin tamamen katılaşmasını sağlamak için plakayı 37 °C'lik bir inkübatöre 1,5-2 saat daha dikkatlice aktarın

3. Fibrin jelin üzerine fibroblastların kaplanması

1. Jelin katılaşmasının son 30 dakikası boyunca, Normal İnsan Akciğer Fibroblastlarını (NHLF) aşağıdaki gibi ayırın:
   1. Bir T175 hücre şişesini 10 mL Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ile yıkayın, ardından 5 mL hücre ayırma solüsyonu ekleyin ve 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
   2. NHLF'yi tam ortamda 20.000 hücre / mL konsantrasyonda yeniden süspansiyon haline getirin.
      NOT: NHLF hücreleri, %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 Penisilin Streptomisin ile takviye edilmiş Dulbecco Modifiye Eagle Medium (DMEM) ile kültürlenebilir.
2. NHLF hücre süspansiyonunun 1 mL'sini her bir oyuğun jeline yerleştirin ve inkübatöre geri yerleştirin.
3. Test süresi boyunca tüm medyayı iki günde bir değiştirin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Steril Pipet uçları	VWR (VWR)
Pipetleyiciler	Eppendorf Belediyesi
Komple EGM2 Medya Bullet Kiti	Fransa	CC-3162	HUVEC Medya
Mem	Gibco (Gibco)	11095114	10T1/2 Medya
DMEM (Ömer Çiçeğ	Gibco (Gibco)	11965118	NHLF Medya
Doku kültürü dereceli PBS	Gibco (Gibco)	14190-144	Magnezyum ve kalsiyum içermez
Aktataz	Yaşam Teknolojileri	A1110501	HUVEC'i kaldırmak için
Tripsin	Yaşam Teknolojileri	15050065	10T 1/2 ve NHLF'yi kaldırmak için
HUVEC ÜNİVERSİTESİ	Fransa	C2517A Serisi
10T 1/2	ATCC (Uzay Servisi)
NHLF (Ulusal Sağlık Örgütü)	ATCC (Uzay Servisi)
Cytodex 3 mikro taşıyıcı boncuklar	Sigma	C3275
Doku kültürü kaplı 6 ve 10 cm'lik plakalar	Corning
Sığır plazmasından fibrinojen	Sigma	F8630
Trombin	Sigma	T9549
Aprotininin	Sigma	A3428
Falcon Yuvarlak Tabanlı Borular	Corning
Doku kültürü inkübatörü ve başlığı
24 oyuklu cam alt plakalar	MatTek	P24G1.513F	Cam tabanlı plakalara yalnızca filizler görüntülenecekse ihtiyaç duyulur. Değilse, doku kültürü plastiği de kabul edilebilir.

Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Belediyesi