1. Larva Temas Testi (Tek Nokta Dozu veya Doz Yanıt Testi)
NOT: Test, test kuyucuklarındaki nihai DMSO konsantrasyonunun %1'i geçmemesi koşuluyla, suda veya dimetil sülfoksitte (DMSO) çözünür olan kimyasallarla gerçekleştirilebilir. Alternatif çözücüler bir seçenek olabilir, ancak öncelikle nihai konsantrasyonun maruziyetten 72 saat sonra %10'dan fazla mortaliteye neden olmadığını doğrulamak önemlidir. Test, tek noktalı bir doz veya doz-yanıt testi olarak gerçekleştirilebilir. İkincisi gerçekleştiriliyorsa, beklenen LC50'yi kapsayan bir konsantrasyon aralığının (en az beş) test edilmesi önerilir.
- Şeffaf 24 oyuklu bir doku plakasının kuyularını etiketleyin.
- 1.5 mL'lik bir tüpte test kimyasının bir stok çözeltisini hazırlayın.
- Her bir kimyayı analitik bir terazi kullanarak tartın ve çözünürlük özelliklerine bağlı olarak steril ddH2O, DMSO veya tercih edilen başka bir uygun organik çözücü içinde yeniden süspanse edin.
not: Hesaplamalar kimyanın saflığını dikkate almalıdır. Örneğin, %99 saf olan bir kimya için,% 1'lik bir çözelti elde etmek için 1.000 μL aseton içinde 10.1 mg çözün. Parafin film ile kapatın ve -20 °C'de saklayın.
- Değerlendirilecek test kimyasının nihai konsantrasyonunu belirleyin ve uygun çözücüyü kullanarak stok çözeltisinden seri seyreltmeleri buna göre hazırlayın.
not: Kimya ve çözücünün konsantrasyonu ve hacmi, C1*V1=C2*V2 formülü kullanılarak hesaplanabilir, burada C1=numune 1'in konsantrasyonu, C2=numune 2'nin konsantrasyonu, V1=numune 1'in hacmi ve V2=numune 2'nin hacmi.
- İstenen test konsantrasyonlarını elde etmek için 10 mM'lik bir stok çözeltisi ve gerektiği gibi seri seyreltmeler hazırlayın (Tablo 1B).
- Geniş delikli bir plastik transfer pipeti kullanarak, beş L3 larvasını bir doku kültürü test plakasının kuyucuğuna aktarın; L3 larvaları uzunluk (~ 2.5 - 3.5 mm) ve ~ 0.025 mm kafa kapsül genişliği ile tanınabilir. Suyu 1 mL'lik bir pipetle nazikçe çıkarın ve istenen hacimde ddH2O ile değiştirin. Tedavi başına n = 4 teknik kopya elde etmek için tekrarlayın (ör., tedavi başına toplam 20 larva).
- 24 oyuklu test plakasındaki dört kopya oyuğunun her birine uygun hacimde test kimyası ekleyin ve kimyanın düzgün bir şekilde karışmasını sağlamak için plakayı hafifçe döndürün. Plakayı sabit koşullar altında bir test veya büyüme odasına yerleştirin (örneğin, 25 °C ve ~ %75-85 RH önerilir ve mümkünse 12 saat ışık/12 saat karanlık döngü önerilir).
not: Deneyler arasında tekrarlanabilirlik için, sonraki tahlillerin aynı çevresel koşullar altında yapıldığından emin olun.
- Maruziyetten 30 dakika, 1, 1.5, 2, 3, 24, 48 ve 72 saat sonra (veya alternatif zaman noktaları) her bir kuyucuktaki ölü / yanıt vermeyen larva sayısını puan tablosuna kaydedin (Tablo 2). Plakanın yan tarafına hafifçe vurun. Herhangi bir hareket gözlenmezse, larvaya steril bir kürdan ile hafifçe dokunun. Dokunmaya/dokunmaya yanıt vermeyen larvaları "ölü" olarak puanlayın.
not: Diğer morfolojik ve davranışsal fenotipler gözlenebilir ve kaydedilebilir.
- İstenirse, değiştirilmiş Abbott formülünü kullanarak kontrol mortalitesini aşağıdaki gibi düzeltin:
Mortalite (%) = (X-Y) *100/(100-Y),
burada X = tedavi edilen numunedeki ölüm yüzdesi ve Y = kontroldeki ölüm yüzdesi .
- Graph-pad Prism 6 veya benzeri gibi tercih edilen bir yazılımı kullanarak sonuçları bir histogram veya logaritmik eğri olarak grafiklendirin ve kontrole göre Ölümcül Konsantrasyon (LC) değerlerini hesaplayın.
- N = 3 veya daha fazla biyolojik kopya elde etmek için ayrı bir sivrisinek partisi kullanarak testi tekrarlayın.
Tablo 1. Aedes aegypti L3 larvası, (A) tek nokta doz testi ve (B) doz-yanıt testi için örnek hesaplamalar.
| A. Üç kimya ile tek nokta doz testleri |
| kimya | Konsantrasyon (400 uM) |
| Amitriptilin | >80 mM Stok: 2 mg amitriptilin X %98 (tozun saflığı) X 0.001 g/1 mg X 1 mol /313.86 g X 1 L/0.08 mol X 106 μL/L = 78.06 μL su. |
| Seri Seyreltmeler: 10 mM elde etmek için stoğu 1:2 ddH2Ove ardından 1:4 oranında seyreltin. 400 μM/kuyucuklu bir nihai konsantrasyon elde etmek için 960 μL ddH20 içeren kuyuya 40 μL 10 mM stok ekleyin. 5 mM, 2.5 mM, 1.25 mM ve 0.625 mM stoklar elde etmek için 10 mM stok 1:2'lik seri seyreltmeler hazırlayın. |
| Cis-(z)-flupenthixol | 80 mM Stok: 2 mg cis(z)flupenthixol X %98 (tozun saflığı) X 0.001 g/1 mg X 1 mol/507.44 g cis(z)flupenthixol X 1L/0.08 mol X 106 μL/L = 48.28 μL su. |
| Seri Seyreltmeler: Yukarıdaki gibi. |
| Amitraz | 80 mM Stok: 2 mg Amitraz X 0.001 g/1 mg X 1 mol/293.4 g amitraz X 1 L/0.08 mol X 106 μL/1 L = 85.21 μL DMSO (not: Amitraz sadece DMSO'da çözünür). |
| Seri Seyreltmeler: Yukarıdaki gibi. |
| >B. Doz-yanıt testi |
| Kimya | Doz 1 | 2. Doz | Doz 3 | 4. Doz | Doz 5 |
| 400 μM | 200 μM | 100 μM | 50 μM | 25 μM |
| ör., Amitriptilin, cis-(Z)-flupenthixol oramitraz | 40 μL | 40 μL | 40 μL | 40 μL | 40 μL |
| 10 mM stok | 5 mM stok | 2,5 mM stok | 1,25 mM stok | 0.625 mM stok |
Tablo 2. Sivrisinek larva doz-yanıt testinden elde edilen verileri kaydetmek için kullanılan örnek puan tablosu. Kontrol, yalnızca su veya yalnızca %1 DMSO veya başka bir çözücü içeren su. Amitriptilin gibi küçük molekül antagonist kimyalarını test etmek için kullanılan tipik dozlar 25 μM, 50 μM, 100 μM, 200 μM ve 400 μM'dir.
| Sivrisinek L3 Larva Testi |
| Başlama tarihi: |
| Araştırmacı: |
| Türler/Tür: |
| Test Tipi: Tek nokta doz / doz yanıtı |
- Ölüm oranı (Hayır. ölü sivrisinek)
| | |
| Zaman (saat) | Doz 1 | 2. Doz | Doz 3 | 4. Doz | Doz 5 | kontrol |
| 0,5 | | | | | | |
| 1 | | | | | | |
| 1.5 | | | | | | |
| 2 | | | | | | |
| 2,5 | | | | | | |
| 3 | | | | | | |
| 12 | | | | | | |
| 24 | | | | | | |
| 48 | | | | | | |
| 72 | | | | | | |
- Yüzde ölüm oranı
|
| Zaman (saat) | Doz 1 | 2. Doz | Doz 3 | 4. Doz | Doz 5 | kontrol |
| 0,5 | | | | | | |
| 1 | | | | | | |
| 1.5 | | | | | | |
| 2 | | | | | | |
| 2,5 | | | | | | |
| 3 | | | | | | |
| 12 | | | | | | |
| 24 | | | | | | |
| 48 | | | | | | |
| 72 | | | | | | |
