$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir
.
1. Sivrisinek Yetişkinlerinin Kültürü
NOT: Sivrisineklerin böcek ilacına duyarlı türleri, Sıtma Araştırma ve Reaktif Referans Deposu'ndan edinilebilir. Önerilen suşlar aşağıdaki gibidir: Aedes aegypti Liverpool (LVP) suşu, Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) suşu ve Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) suşu.
- Nuss tarafından tarif edildiği gibi 25 cm x 40 cm'lik plastik tepsilerde (tepsi başına ~ 400 larva) 28 ° C'de ve% 75-85 bağıl nemde (RH) 12 saat gündüz/12 saat gece döngüsünde yumurtalardan sivrisinek larvalarını kültürleyin. Larvaları öğütülmüş gerbil (A. aegypti ve An. gambiae) veya pul balık yemi (C. quinquefasciatus) ile besleyin. Larva tahlilleri için, larvaları üçüncü larva (L3) instar aşamasında toplayın.
- Plastik kaplara aktarılan pupalardan arka yetişkin sivrisinekler ve yukarıda açıklanan koşullar altında bir böcek içinde 20 L'lik plastik kafeslerin içine yerleştirilir. Sivrisinekleri başka bir yerde açıklandığı gibi% 20 şeker çözeltisi üzerinde tutun. Ortaya çıktıktan 3-5 gün sonra yetişkinleri toplayın.
2. Yetişkin Topikal Testi (Tek Nokta Dozu veya Doz Yanıt Testi)
NOT: Yetişkin topikal testi, çözücü olarak aseton kullanılarak gerçekleştirilir. Alternatif çözücüler bir seçenek olabilir, ancak öncelikle nihai konsantrasyonun maruziyetten 48 saat sonra %10'dan fazla mortaliteye neden olmadığını doğrulamak önemlidir. Test, tek noktalı bir doz veya doz-yanıt testi olarak gerçekleştirilebilir ve ölümcül dozu (LD) belirlemek için kullanılır. İkincisi gerçekleştiriliyorsa, beklenen LD50'yi kapsayan bir konsantrasyon aralığının (en az beş) test edilmesi önerilir.
- Testi tamamlamak için gereken yetişkin dişi sivrisinek sayısını belirleyin.
not: Tek bir kimyaya sahip bir nokta doz tahlili en az 90 sivrisinek gerektirecektir (pozitif kontrol için 30, sadece aseton negatif kontrol için 30 ve test kimyası için 30).
- Kültür 3 ila 5 günlük yetişkin dişi sivrisinekler ve bir aspiratör kullanarak ayrı bir 20 mL plastik kovaya geçin (Şekil 1).
- 9 oz kağıt bardakları test kimyasının adı ve konsantrasyonu ile etiketleyin. Her fincan için 10 cm x 10 cm gözenekli kareler ve lastik bantlar ayırın (bkz. Şekil 2).
- Pozitif kontrol olarak mevcut bir insektisit seçin (örneğin, sentetik piretroid, bifentrin) ve asetonda %1'lik bir stok solüsyonu (10 μg/μL) hazırlayın.
NOT: Hesaplamalar kimyanın saflığını dikkate almalıdır. Örneğin, %99 saf olan bir kimya için,% 1'lik bir çözelti elde etmek için 1.000 μL aseton içinde 10.1 mg çözün. Parafin film ile kapatın ve -20 °C'de saklayın.
- Yukarıdakiyle aynı prosedürü kullanarak, test kimyasının bir stok çözeltisini hazırlayın.
not: Birçok test kimyası oldukça kararsızdır ve biyo-tahlil her yapıldığında çözeltiler tercihen taze yapılmalıdır.
- Daha önce asetonla durulanmış 20 mL cam şişeler kullanarak, Şekil 3'te gösterildiği gibi stok çözeltilerinden pozitif kontrol ve test kimyalarının seri seyreltmelerini hazırlayın.
- 1 mL'lik bir cam şırıngayı asetonla temizleyin, asetonla doldurun ve 0,25 μL'lik bir hacim sağlayacak şekilde ayarlanmış mikro aplikatörde sabitleyin.
- On kişilik gruplar halinde çalışarak, 3-5 günlük yetişkin dişi sivrisinekleri bir aspiratör kullanarak kafeslerden çıkarın ve buzdolabında veya buz üzerinde 4 ° C'de beş dakikaya kadar anestezi uygulayın. Daha sonra, sivrisinekleri bir Petri kabına aktarın ve 10 dakikaya kadar buzun üzerine koyun.
- Hızlı çalışarak, ince cımbızla tek bir dişi çıkarın ve şırınga mikro aplikatörünü kullanarak dorsal toraksa 0.25 μL test solüsyonu uygulayın. Her sivrisineğin uygun hacimde test kimyası aldığından emin olmak için bir diseksiyon mikroskobu kullanarak gözlem yaparak kimyanın teslimini onaylayın.
- Sivrisinekleri buz üzerinde duran etiketli bir kağıt bardağa aktarın ve n = 10 tedavi edilmiş sivrisinek elde etmek için dokuz kez tekrarlayın. Sivrisinekleri kapta bir lastik bantla sabitlenmiş bir ağ kare ile kapatın ve 28 ° C ve% 75-85 bağıl nem sabit koşulları altında plastik bir küvete veya büyüme odasına aktarın (12 saat gündüz / 12 saat gece döngüsü tercih edilir).
- Tedavi veya kontrol grubu başına n = 3 teknik kopya (yani toplam 30 sivrisinek) elde etmek için yukarıdaki deneyi iki kez tekrarlayın.
- Önce test kimyası ve ardından pozitif kontrol ile 2.7 - 2.10 arasındaki adımları tekrarlayın.
not: Yeterli sivrisinek bulunup bulunmadığını dahil etmek için bir başka yararlı kontrol, test kimyası veya çözücü almayan 30 anestezi uygulanmış sivrisineğin "boş" olmasıdır.
- Skor sayfasını kullanarak maruziyetten 30 dakika, 60 dakika, 2, 24 ve 48 saat sonra (veya alternatif zaman noktaları) "ölü / yanıt vermeyen" sivrisineklerin sayısını kaydedin (Tablo 1). Sivrisinekleri, bir tarafa veya sırt üstü yatma ve uçamama ile tanımlanan hareket eksikliği gösteriyorlarsa "ölü / tepkisiz" olarak puanlayın.
- İstenirse, değiştirilmiş Abbott formülünü aşağıdaki gibi kullanarak kontrol mortalitesini düzeltin:
Mortalite (%) = (X-Y) *100/(100-Y),
burada X = tedavi edilen numunedeki ölüm yüzdesi ve Y = kontroldeki ölüm yüzdesi .
- Sonuçları histogram veya üstel eğri olarak görüntüleyin. Bir doz-yanıt tahlili için, kontrole göre test kimyası için LD50, LD 75 veya LD90 değerini hesaplayın.
- N = 3 veya daha fazla biyolojik kopya elde etmek için ayrı sivrisinek grupları kullanarak testi en az iki kez tekrarlayın.
