$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Lentivirus üretimi
NOT: Lentiviral vektörlerin üretimi ve manipülasyonu, rekombinant DNA içeren araştırmalar için Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) yönergelerine göre gerçekleştirilmiştir. Vahşi tipi kodlayan plazmid ve gelişmiş YFP (SOD1WT-YFP ve SOD1A4V-YFP) ile etiketlenmiş A4V mutant SOD1 kullanılır. Her iki gen füzyon ürünü, PCR primer çifti 5'-ATCGTCTAGACACCATGGCGACGAAGGTCGTGTGC-3' ve 5'-TAGCGG CCGCTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3' kullanılarak amplifiye edildi ve XhoI ve BsrGI kısıtlama bölgeleri kullanılarak pTRIP-delta U3 CMV plazmidine yerleştirildi. 20'den fazla geçişten kaçınma ve hücrelerin %60'tan daha az birleşmede tutulması, iyi transfeksiyon verimliliklerinin sağlanmasına yardımcı olur.
- 1. Günde, HEK-293T hücrelerini, 10 mL hücre kültürü ortamında (%10 FBS ve 4 mM L-glutamin ile yüksek glikozlu DMEM) 10 cm çapında bir doku kültürü plakasında (3 x 10⁶ hücre / tabak) %30 - 40 birleşimde bölün
.
- 10 cm çapındaki doku kültürü plakasını gece boyunca bir CO₂ inkübatörde (37 °C, %5 CO₂) tutun.
- 2. Günde, lentiviral ambalaj plazmitleri (5 μg pVSVg; 10 μg pCMV-dR8.71) ile birlikte 10 μg lentiviral vektör (pTRIP-delta U3 CMV - SOD1WT-YFP veya -SOD1A4V-YFP) içeren bir DNA transfeksiyon solüsyonu hazırlayın (Şekil 1A). 125 μL 1 M CaCl₂ ekleyin ve damıtılmış su kullanarak hacmi 500 μL'ye ayarlayın. Karışıma yavaşça 500 μL 0,05 M HEPES ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
- HEK-293T hücre ortamını 1 mL DNA transfeksiyon çözeltisi ile karıştırılmış 10 mL önceden ısıtılmış taze kültür ortamı ile değiştirin ve gece boyunca 37 °C, %5 CO₂'de inkübe edin.
- 3. Günde, hücre süpernatanı taze kültür ortamı ile değiştirin.
- 4. Günde, süpernatanı 15 mL'lik bir tüpte hasat edin ve ölü hücreleri ve kalıntıları çıkarmak için 500 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı, 60 mL'lik büyük bir şırınga kullanarak 0,45 μm'lik bir filtreden geçirerek daha da saflaştırın. Hemen tek kullanımlık alikotlara (300 μL) dağıtın ve -80 ° C'de saklayın. Maksimum ürün aktivitesini korumak için donma-çözülme döngüsünden kaçının.
2. Lentiviral transdüksiyon
- Enfekte olacak hücre hattını% 60 birleşmede (HEK-293 hücreleri ve SH-SY5Y; oyuk başına 5 x 10⁵ hücre ve U2OS; kuyu başına 1 x 10⁵ hücre) 6 oyuklu bir doku kültürü plakasında 2 mL DMEM ortamında bölün% 10 FBS ile desteklenmiş.
- 6 oyuklu doku kültürü plakasını gece boyunca %5 CO₂'de 37 °C'lik bir inkübatörde tutun.
- Dondurulmuş lentivirüsü -80 ° C dondurucudan çıkarın ve her kullanımdan önce buz üzerinde bir alikot çözün; tekrar dondurmayın.
- Virüs çözülürken, ilgilenilen hücre hattı ile uyumlu serumu içeren hücre kültürü ortamını ısıtın. Virüs tamamen çözüldükten sonra, 1.5 mL'lik taze bir mikrofüj tüpünde DMEM'de bir dizi seyreltme (1: 3, 1: 10, 1: 30 ve 1: 100) hazırlayın.
- Azaltılmış serum ortamı ile tüplerdeki hacmi 1 mL'ye getirin.
- 1 mL virüs/besiyerine 2 μL Polibren (4 μg/μL stokta) ekleyin. Pipetleyerek iyice karıştırın ve hücrelere 1 mL karışım ekleyin. Hücreleri virüsle 24 saat inkübe edin.
- Virüs ortamını çıkarın ve% 10 FBS ile desteklenmiş normal DMEM ortamı ile değiştirin. Hücreleri 37 °C, %5 CO₂'de tutun.
- Hücrelerin büyümesini izleyin ve kültür ortamını her iki günde bir değiştirin. Birleşme noktasında, 6 oyuklu çanağı 10 cm çapında bir doku kültürü plakasına genişletin.
- Hücreler yeterince genişledikten sonra, YFP etiketli proteinin ekspresyon seviyesini mikroskopi ile kontrol etmek için 384 oyuklu tahlil plakalarında 50 μL DMEM ortamında kuyucuk başına 1.5 x 10⁴ hücre tohumlayın. YFP etiketli protein hücre ekspresyonu ≥3 bir sinyal-gürültü oranı gösteriyorsa, karşılık gelen hücre hattı için hücre stoğunu hazırlayın.
3. Proteazom inhibitörünün protein agregasyonu üzerindeki zamana bağlı etkisi
NOT: Otomatik bir mikroskop kullanarak görüntü elde edin (bkz.
- 384 oyuklu düz tabanlı plakalarda% 100 DMSO (ALLN, 2 mM) içinde çözülmüş 0.25 μL DMSO veya proteazom inhibitörü dağıtın.
- Aynı tahlil plakası üzerinde 50 μL DMEM ortamında oyuk başına 1.5 x10 4 hücreyi manuel olarak tohumlayın. Proteazom inhibitörü (ALLN) nihai konsantrasyonu 10 μM olmalıdır.
- Mikroskop sistemi çevre kontrol ünitesini 37 °C ve %5 CO₂'ye ayarlayın. Deney düzeneğinin bir ekran görüntüsü Şekil 2'de gösterilmektedir.
- Yazılımı aşağıdaki ayarlarla kullanarak mikroskobu geniş alan floresan modunda çalıştırın: LWD 20X objektif, konfokal olmayan mod, 4 alan/kuyu, bir saatlik yakalama aralığı ile. Her çalıştırmanın sonunda, yakalanan görüntüler otomatik olarak sunucuya yüklenir.
4. Canlı hücrelerde YFP ekspresyonu için hızlandırılmış görüntüleme ve görüntü analizi (tek kanal)
NOT: Aşağıdaki adımlar, yazılımın uygulamasını açıklar (örneğin, Columbus).
- Birincil nesneleri (sitozol ve agregalar) segmentlere ayırmak için uygun algoritmayı seçin. Gerekirse, arka plan eşiğini ve kontrast parametrelerini ayarlayın (Şekil 3).
- YFP yoğunluk kanalı için ayrı bir eşik değeri 0,1 olan 'hücreleri bul' kullanarak hücreleri sayın. Göreceli YFP nokta yoğunluğu >0,2 ve bölme katsayısı 1,0 olan bir 'nokta bul' algoritması kullanarak agregaları belirleyin.
5. Proteazom inhibitörlerinin çekirdekleri için boyanmış canlı hücreler üzerinde protein agregasyonu üzerindeki doz yanıtı etkisi (iki kanal)
NOT: Otomatik bir mikroskop kullanarak görüntü elde edin. Optimal bir eğri uyumu sağlamak için beklenen IC50 değerine göre proteazom inhibitörlerinin (ALLN, Epoksomin ve MG132) konsantrasyon aralığını belirleyin.
- Standart 1: 3 seyreltme serisi ile 384 oyuklu bir depolama polipropilen plaka üzerinde bileşiklerin seri seyreltmelerini hazırlayın. Bileşik konsantrasyonlarının doğru olduğundan emin olmak için bileşik seyreltmelerini iyice karıştırdığınızdan emin olun.
- Boş düz tabanlı siyah 384 kuyulu tahlil plakalarına 0.25 μL proteazom inhibitörü dağıtın. Hacimleri aktarabilen 384 kılcal kafa ile donatılmış bir sıvı işleyici kullanıyoruz.
- Tahlil plakalarında 50 μL DMEM Besiyerinde oyuk başına 1,5 x 1010⁴ hücre tohumlayın. Test plakalarını 37 °C'de ve %5 CO₂'de 24 saat inkübe edin.
- Boyama solüsyonu (10 mg / mL'lik bir stokta Hoechst 33342) ile 10 μL DMEM Media (37 ° C'de önceden ısıtılmış) ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
- Mikroskop çalıştırma yazılımını başlatın. Deney düzeneğinin bir ekran görüntüsü Şekil 4'te gösterilmektedir. "Konfigürasyon" sekmesini seçin ve 20X objektifi ve doğru plaka tipini seçin. "Yaka"nın objektif üzerinde doğru değere ayarlandığından emin olun, böylece farklı plaka tipleriyle uygun odaklama sağlanır.
- "Mikroskop" sekmesini seçin. Pozlama 1'i YFP (488 lazer) ve pozlama 2'yi Hoechst (405 lazer) olarak tanımlayın. Filtreyi her iki pozlamada da etkinleştirin ve pozlama 1'i kamera 1'e ve pozlama 2'yi kamera 2'ye atayın. Pozlama sürelerini pozlama 800 için ~1 ms ve pozlama 40 için ~2 ms olarak ayarlayın.
- Pozlamayı seçin 1. Odak yüksekliğini 0 μm olarak ayarlayın. "Odak" ı seçin. Odaklandıktan sonra kamerayı pozlama 1. Pozlama düzlemini optimize etmek için odak yüksekliğini ayarlayın ve "Yüksekliği al" seçeneğine tıklayın. Maksimum ~3.000 piksel yoğunluğu vermek için pozlama sürelerini ve lazer gücünü değiştirin. Pozlama parametrelerini kaydedin. Pozlama için tekrarlayın 2.
- "Deney Tanımı" sekmesini seçin. Bir düzen ve alt düzen oluşturun. İlgili düzeni, pozlamayı, referans görüntüsünü, eğrilik kırpma dosyasını ve alt düzeni sürükleyip bırakın. Denemeyi kaydedin.
- "Otomatik Deneme" sekmesini seçin ve görüntüleri alın. Her çalıştırmanın sonunda, yakalanan görüntüler otomatik olarak sunucuya yüklenir.
6. İki kanallı görüntülerin görüntü analizi
- Birincil nesneleri (çekirdekler, sitozol ve agregalar) segmentlere ayırmak için yazılım algoritmasını seçin (Şekil 5).
- Segmentlere ayrılmış nesnelerin görsel olarak incelenmesiyle çekirdekleri doğru bir şekilde segmentlere ayıran yöntemi seçin. Kanal 1'deki (Ch1) Hoechst lekeli nesneler, hücre sayısını belirlemek için kullanılacaktır. Kanal 2'deki (Ch2) mutant SOD1-A4V'den elde edilen YFP boyama, agrega miktarını belirlemek için kullanılacaktır.
- 'Çekirdek bul' algoritmasını kullanarak hücreleri, Hoechst boyama bölgeleri >20 μm², bölme faktörü 7.0, bireysel eşik 0.40 ve kontrast >0.10 olarak sayın.
- Veri tablosunu oluşturun ve grafik yazılımındaki 'Doğrusal olmayan regresyon' denklemini kullanarak bileşiklerin her biri için EC50'yi belirleyin.
