İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Endotoksin Aktivite Testi (EAA)
- Hasta kan örneklerini EDTA antikoagülan içeren steril tüplerde toplayın. Kan örneklerini oda sıcaklığında saklayın
- Test etmeniz gereken her hastanın kan örneği için EA test tüplerini hazırlayın. Tüpleri tüp raflarına koyun. Ardından kapakları çıkarın.
- Her EA testi 5 farklı tüp türünden oluşur; her birini testin farklı bir kısmı için kullanın (sonraki adımlara bakın).
- Spesifik bir antikorun yokluğunda hastanın nötrofillerinin spesifik olmayan oksidatif patlamasının bazal aktivitesini ölçmek için tüp #1'i ("Kontrol" tüpü) kullanın.
- Lipopolisakkarit (LPS)-antikor kompleksine yanıt olarak oksidatif patlamayı ölçmek için tüp #2'yi ("Örnek" tüpü) kullanın.
- Aşırı endotoksine yanıt olarak hastanın nötrofillerinin maksimum oksidatif patlamasını ölçmek için tüp # 3'ü ("Max" tüp) kullanın.
- Ekzojen endotoksin kaynağı olarak tüp # 4'ü ("LPS" tüpü) kullanın.
- Kan saklamak için tüp #5 ("Aliquot" tüpü) kullanın.
NOT: Test edilen her kan numunesi için kullanılacak toplam 8 tüp için #1, #2 ve #3 tüplerinin kopyaları sağlanmıştır (EA reaktif şişesi ve kalite kontrol testi, bir poşette bulunan tüm testler için kullanılabilir).
- Bir kombi pipet kullanarak, şişeden 1 mL hacimde bir EA reaktifini #1 (Kontrol tüpü), #2 (Numune tüpü) ve #3 (Maks. tüp) tüplerine, her biri çift olarak pipetleyin.
NOT: Çözeltinin tekrar sıçramasını önlemek için tüpün yan tarafından pipetleyin.
- Kan alma tüpünü 20 kez hafifçe ters çevirerek hasta kan örneğini karıştırın. Ardından, 0.5 mL hasta kanını tüp # 4'e (LPS max tüp) ve tüp # 5'e (Aliquot tüpü) pipetleyin. 10 saniye boyunca vorteks tüpü #4.
- Tüp raflarını tüm EA test tüpleriyle birlikte inkübatör çalkalayıcıya yerleştirin. Kapağı kapatın ve 37°C sıcaklıkta 10 dakika inkübe edin.
- Kapağı açın ve tüp raflarını inkübatör çalkalayıcıdan çıkarın. Vorteks tüpü #5 (Aliquot tüpü). Steril bir uç kullanarak, 40 μL kanı iki parça halinde #1 ve #2 numaralı tüplere pipetleyin.
- Vorteks tüpü #4 (LPS tüpü). Aynı pipet ucunu kullanarak, tüp #4'ten tüp #3'e (Max tüp) 40 μL kanı iki parça halinde pipetleyin.
- Son altı test tüpünü (#1, #2, #3 ve ilgili kopyalar) girdaplayın, ardından raflarına geri yerleştirin.
NOT: Tüm tüplerin aynı süre boyunca girdaplı olduğundan emin olun.
- Tüp raflarını inkübasyon çalkalayıcıya geri koyun ve kapağı kapatın. İnkübe çalkalayıcıyı 100 rpm'ye ayarlayın, ardından hareketi 14 dakika boyunca başlatın.
- EA etiketli çipli kartı kemilümometreye takın ve başlat düğmesine basın. 14 dakikalık inkübasyondan sonra, EA tüplerini doğru sırayla okumak için kemilüminometrede görüntülenen talimatları izleyin.
- Kemilüminometrenin numune tutucusuna yerleştirmeden önce her bir tüpü 10 saniye boyunca hafifçe girdaplayın. Numune çekmecesini açın ve tüp #1'i numune tutucuya yerleştirin. Ardından, numune çekmecesini kapatın ve Bağıl Işık Birimi (RLU) okumasını bekleyin.
- Tüp 2 ve tüp 3 için adım 1.12'yi tekrarlayın.
- Çift tüpler 1, 2 ve 3.
için adım 1.12'yi tekrarlayın
not: 1.12–1.14 arasındaki adımlar sırasında tüm tüpleri aynı süre boyunca girdaplamaya çalışın.
- Tüm tüpler işlendikten sonra, EA sonuçlarının otomatik olarak hesaplanacağını ve yazdırılacağını unutmayın. Seviyeler EA birimleri olarak ifade edilir ve aynı örneklerden elde edilen mükerrer belirlemelerin ortalamasını temsil eder.
- Test edilmesi gereken her kan örneği için 1.4 ila 1.15 arasındaki adımları tekrarlayın.
- Test tamamlandıktan sonra, kalan test tüplerini ve EA reaktiflerini 2-8 °C'de 30 güne kadar saklayın.