Türbidimetrik Limulus Amiposit Lizat Testi: Nano Formüllü İlaçlarda Endotoksin Kontaminasyonunu Tespit Etmek ve Ölçmek İçin Bir Teknik

Özet

Kaynak: Neun, BW ve diğerleri, Limulus Amiposit Lizat (LAL) Tahlilleri Kullanılarak Nano Formülasyonlarda Endotoksin Tespiti. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, PEGile lipozomal doksorubisin nano formülasyonlarında endotoksin kontaminasyonunu tahmin etmek için Limulus amoebosit lizat veya LAL testinin türbidimetrik formatını açıklar. Endotoksinin LAL reaktifi ile reaksiyonunu takiben çözeltinin bulanıklığı, numunedeki endotoksinin tahmin edilmesine yardımcı olur.

Protokol

1. Nanopartikül Numunelerinin Hazırlanması

1. Çalışma örneğini LAL dereceli suda hazırlayın.
2. Numune pH'ı 6-8 aralığının dışındaysa, pirojen içermeyen sodyum hidroksit veya hidroklorik asit kullanarak pH'ı ayarlayın.
3. LAL dereceli su kullanarak, çalışma örneğinin birkaç seyreltmesini hazırlayın. En yüksek seyreltmenin maksimum geçerli seyreltmeyi (MVD) aşmadığından emin olun.

2. LAL Formatları Arasında Ortak Reaktiflerin Hazırlanması

1. 0.1 N konsantrasyonda bir çalışma çözeltisi hazırlamak için konsantre sodyum hidroksit stoğunu pirojen içermeyen LAL reaktif suyu kullanarak seyreltin.
2. Konsantre hidroklorik asit stoğunu pirojen içermeyen LAL reaktif suyu kullanarak seyreltin ve 0.1 N'lik bir nihai konsantrasyonda çalışan bir çözelti hazırlayın.
3. Kontrol Standardı Endotoksinin (CSE) Hazırlanması
   1. CSE'yi üretici tarafından sağlanan analiz sertifikasına göre yeniden oluşturun.
      not: Belirli bir CSE formülasyonunun farklı LAL formatlarında katalog numarası ve uygulamasıyla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
4. LAL Reaktifinin Hazırlanması
   1. LAL reaktifini, üretici tarafından sağlanan analiz sertifikasına göre sulandırın.
      not: Belirli bir LAL reaktif formülasyonunun farklı LAL formatında katalog numarası ve uygulaması ile ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

3. Bulanıklık LAL Testi

1. Kalibrasyon Standartlarının Hazırlanması
   1. 900 μL LAL sınıfı su ve 100 μL CSE kullanarak, 0,001 ila 1 EU/mL konsantrasyon aralığına sahip bir kalibrasyon standardının hazırlanmasını sağlamak için gerektiği kadar ara seyreltme hazırlayın.
   2. Önce tüpleri etiketleyin ve her tüpe 900 μL LAL sınıfı su ekleyin. Daha sonra 1EU/mL konsantrasyonda kalibrasyon standardı hazırlamak için 100 μL 10 EU/mL solüsyon ekleyin.
   3. Üç düşük kalibrasyon standardı hazırlamak için yukarıda açıklandığı gibi seri 10 kat seyreltmeyi tekrarlayın. 0,001 ila 1 EU/mL arasında değişen dört kalibrasyon standardının hazırlandığını doğrulayın.
2. Kalite Kontrollerinin Hazırlanması
   1. 50 μL 1 EU/mL CSE solüsyonunu 950 μL LAL sınıfı su ile birleştirerek 0,05 EU/mL kalite kontrolü hazırlayın.
3. İnhibisyon/Geliştirme (IEC) Kontrollerinin Hazırlanması
   1. Belirli bir seyreltmede 25 μL 1 EU/mL CSE çözeltisi ve 475 μL test nanomalzemesini birleştirerek IEC'yi 0.05 EU/mL konsantrasyonda hazırlayın.
4. Deneysel prosedür
   1. Aleti yaklaşık 30 dakika önceden açarak ısınmasına izin verin. Algılama dalga boyunu 660 nm'ye ayarlayın, çünkü bu bulanıklık LAL için uygundur.
   2. Kullanıcı adını ve parolayı yazarak oturum açın.
   3. Bilgisayar ekranındaki ilgili simgeye tıklayarak yazılımı (Malzeme Tablosu) açın.
   4. Yazılım ana ekranında Veri topla'yı seçin. Test ID'sini ve veri grubu bilgilerini ana ekrandaki Genel sekmesinde bulunan ilgili alana girin.
   5. Donanım sekmesine tıklayın. Açılır menüden enstrüman türünü seçin.
   6. LAL bulanıklık yöntemini seçerek LAL bulanıklık için uygun olduğu için algılama dalga boyunu 660 nm'ye ayarlayın.
   7. Ekranda bir seri numarası, sistem kimliği ve seri bağlantı noktası bilgilerinin göründüğünü doğrulayın. Tamam'a tıklayın. Onaylamak için bir kez daha Tamam'a tıklayın.
   8. Numune kimliğini, numunenin test edildiği sırayla girin. Negatif kontrolü, standart eğriyi ve test örneklerini girmek için varsayılan düğmeleri kullanın.
   9. Her numune için çift tüpler hazırlayın ve önceden etiketlenmiş cam tüplere 200 μL (test oranı 4:1) veya 100 μL (test oranı 1:1) negatif kontrol (su), kalibrasyon standartları, kalite kontrol, IEC ve test nanopartikülleri ekleyin.
   10. İlk test şişesine 50 μL (test oranı 4: 1) veya 100 μL (test oranı 1: 1) LAL reaktifi ekleyin, kısaca vorteksleyin ve cihaz karuselindeki test yuvasına yerleştirin. 1:1 oranı kullanılırsa, LAL reaktifinin hacmi 100 μL'dir.
   11. Diğer numuneler için yukarıda açıklanan prosedürü tekrarlayın. Numuneleri teker teker işleyin.
        

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sodyum Hidroksit	Sigma	S2770 Serisi	Gerektiğinde, numune pH'ını 6-8 arasında olacak şekilde ayarlamak için kullanılır
hidroklorik asit	Sigma	H9892	Gerektiğinde, numune pH'ını 6-8 arasında olacak şekilde ayarlamak için kullanılır
LAL Reaktifi	Cape Cod'un Ortakları	T0051	Bu reaktif sadece bulanıklık testi ile kullanılabilir
Kontrol Endotoksin Standardı	Cape Cod'un Ortakları	E0005	Bu reaktif, bulanıklık ve jel-pıhtı tahlilleri ile kullanılabilir
LAL sınıfı su	Cape Cod'un Ortakları	WP0501	Bu reaktif herhangi bir LAL formatı ile kullanılabilir
Glucashield Tamponu	Cape Cod'un Ortakları	GB051-25	Beta-glukanlardan yanlış pozitif yanıtı önlemek için kullanılır
Tek kullanımlık endotoksin içermeyen cam seyreltme tüpleri 12 x 75 mm	Cape Cod'un Ortakları	TB240	Bu tüpler her üç tahlil ile de kullanılabilir
Tek kullanımlık endotoksin içermeyen cam reaksiyon tüpleri 8 x 75 mm	Cape Cod'un Ortakları	TK100	Bu tüpler bulanıklık ve kromojenik tahlillerle birlikte kullanılabilir
0,25 ve 1,0 mL hacimli pirojen içermeyen uçlar	YAĞMUR SUYU	PPT25, PPT10	Uçlar ve pipetler endotoksini adsorbe edebilir ve LAL testine müdahale eden sızabilir maddeleri serbest bırakabilir. Bu RAININ uçları, LAL tahlilindeki optimum performansları doğrulandığı ve onaylandığı için kullanılır
Pirojen içermeyen mikrosantrifüj tüpleri, 2.0 mL	Eppendorf Belediyesi	22600044	Diğer eşdeğer malzemeler kullanılabilir
Pirojen ücreti kombiuçları, 5 mL	Eppendorf Belediyesi	30089669	Diğer eşdeğer malzemeler kullanılabilir
Pipetleyiciyi tekrarlayın	Eppendorf Belediyesi	4982000020	Diğer eşdeğer malzemeler kullanılabilir
Mikrosetrifüj	herhangi bir marka		Herhangi bir marka kullanılabilir
Buzdolabı, 2-8 C	herhangi bir marka		Herhangi bir marka kullanılabilir
girdap	herhangi bir marka		Herhangi bir marka kullanılabilir
Derin dondurucu, -20 C	herhangi bir marka		Herhangi bir marka kullanılabilir
Pyros Kinetix veya Pyros Kinetix Flex okuyucu	Cape Cod'un Ortakları	PKF96	Diğer enstrümanlar da kullanılabilir. Bununla birlikte, bu testte kullanılan LAL reaktifleri ve endotoksin standartları optimizasyon gerektirebilir. Başka bir enstrümantasyon kullanıldığında, talimatlar için lütfen cihaza ve LAL kiti üreticilerine bakın

Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi