Jel-Pıhtı Limulus Amip Lizat Testi: Nanopartikül Formülasyonlarında Bakteriyel Endotoksin Tayini İçin Bir Yöntem

Özet

Kaynak: Neun, BW ve diğerleri, Limulus Amiposit Lizat (LAL) Tahlilleri Kullanılarak Nano Formülasyonlarda Endotoksin Tespiti. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu videoda, at nalı yengeçlerinin kan hücrelerinden elde edilen Limulus Amip Losit Lizat kullanılarak nano formülasyonlarda bakteriyel endotoksinlerin varlığını belirlemek için bir jel-pıhtı testi açıklanmaktadır. Test, nano bazlı formülasyonlar da dahil olmak üzere farmasötik ürünlerin endotoksin kontaminasyonunun test edilmesine yardımcı olur.

Protokol

1. Nanopartikül Numunelerinin Hazırlanması

1. Çalışma örneğini LAL dereceli suda hazırlayın.
2. Numune pH'ı 6-8 aralığının dışındaysa, pirojen içermeyen sodyum hidroksit veya hidroklorik asit kullanarak pH'ı ayarlayın.
3. LAL dereceli su kullanarak, çalışma örneğinin birkaç seyreltmesini hazırlayın. En yüksek seyreltmenin maksimum geçerli seyreltmeyi (MVD) aşmadığından emin olun.

2. LAL Formatları Arasında Ortak Reaktiflerin Hazırlanması

1. 0.1 N konsantrasyonda bir çalışma çözeltisi hazırlamak için konsantre sodyum hidroksit stoğunu pirojen içermeyen LAL reaktif suyu kullanarak seyreltin.
2. Konsantre hidroklorik asit stoğunu pirojen içermeyen LAL reaktif suyu kullanarak seyreltin ve 0.1 N'lik bir nihai konsantrasyonda çalışan bir çözelti hazırlayın.
3. Kontrol Standardı Endotoksinin (CSE) Hazırlanması
   1. CSE'yi üretici tarafından sağlanan analiz sertifikasına göre yeniden oluşturun.
      not: Belirli bir CSE formülasyonunun farklı LAL formatlarında katalog numarası ve uygulamasıyla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
4. LAL Reaktifinin Hazırlanması
   1. LAL reaktifini, üretici tarafından sağlanan analiz sertifikasına göre sulandırın.
      not: Belirli bir LAL reaktif formülasyonunun farklı LAL formatlarında katalog numarası ve uygulaması ile ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

3. Jel-Pıhtı LAL

NOT: Bu test, reaksiyon tüpündeki bir pıhtının görsel gözlemine ve tespitine dayalı olarak numunedeki endotoksinlerin varlığını tanımlar. Deneysel adımlar aşağıda açıklanmıştır. Sonuçları kaydetmek için bir tezgah sayfası kullanın. Bu tezgah sayfası zorunlu değildir ve tahlil sonuçlarını kaydetmenin diğer yolları da kabul edilebilir. Böyle bir tezgah sayfasının bir örneği, bir okuyucunun rahatlığı için ek materyallerde verilmiştir. Lambda (l), jel-pıhtı testinin duyarlılığıdır ve 0.03 EU/mL'dir.

1. Analiz edilen test numunelerinin sayısını karşılamak için gerektiği kadar reaksiyon tüpünü etiketleyin. Testin 1. adımında, 2. adımında ve 3. adımında kullanılan kopya sayısıyla ilgili ayrıntılar için tezgah sayfasına bakın.
2. Tüp başına 100 μL su, kontrol veya test numunesi alikot.
3. CSE'yi nihai konsantrasyon 4λ'ya eşit olacak şekilde hazırlayın.
4. Yukarıda belirtilen standardın 100 μL'sini 100λ'lik CSE'nin nihai konsantrasyonunu elde etmek için 2 μL su veya test numunesi ile birleştirin. Lambda ve yarım lambda ve çeyrek lambda elde etmek için üç kez daha tekrarlayın.
5. Su banyosundaki sıcaklığın 37 °C olduğundan emin olun.
6. Test tüpü başına 100 μL lizat ekleyin, kısaca girdap yapın ve tüm tüplerle birlikte rafı 1 saat boyunca su banyosuna yerleştirin.
7. Tüpü yumuşak bir hareketle ters çevirin.
8. Tezgah sayfasında "+" (sert pıhtı) veya "-" (pıhtı veya gevşek pıhtı yok) kullanarak sonuçları manuel olarak kaydedin.
9. USP BET 85'e göre analize devam edin; tezgah sayfasını destekleyici malzeme olarak kullanın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
LAL reaktifi	Cape Cod'un Ortakları	G5003	Bu reaktif, jel pıhtı tahliline özgüdür
Endotoksin standardını kontrol	Cape Cod'un Ortakları	E0005	Bu reaktif, bulanıklık ve jel pıhtı tahlilleri ile kullanılabilir
Sodyum hidroksit	Sigma	S2770 Serisi	Gerektiğinde, numune pH'ını 6-8 arasında olacak şekilde ayarlamak için kullanılır
hidroklorik asit	Sigma	H9892	Gerektiğinde, numune pH'ını 6-8 arasında olacak şekilde ayarlamak için kullanılır
LAL sınıfı su	Cape Cod'un Ortakları	WP0501	Bu reaktif herhangi bir LAL formatı ile kullanılabilir
Glucashield tamponu	Cape Cod'un Ortakları	GB051-25	Beta-glukanlardan yanlış pozitif yanıtı önlemek için kullanılır
Tek kullanımlık endotoksin içermeyen cam seyreltme tüpleri 12 x 75 mm	Cape Cod'un Ortakları	TB240	Bu tüpler her üç tahlil ile de kullanılabilir
Tek kullanımlık endotoksin içermeyen cam reaksiyon tüpleri 10 x 75 mm	Cape Cod'un Ortakları	TS050	Bu tüpler jel-pıhtı tahlili ile kullanım içindir
0,25 ve 1 mL hacimli pirojen içermeyen uçlar	YAĞMUR SUYU	PPT25, PPT10	Uçlar ve pipetler endotoksini adsorbe edebilir ve LAL testine müdahale eden sızabilir maddeleri serbest bırakabilir. Bu RAININ uçları, LAL tahlilindeki optimum performansları doğrulandığı ve onaylandığı için kullanılır
Pirojen içermeyen mikrosantrifüj tüpleri, 2.0 mL	Eppendorf Belediyesi	22600044	Diğer eşdeğer malzemeler kullanılabilir
Pirojen ücreti kombiuçları, 5 mL	Eppendorf Belediyesi	30089669	Diğer eşdeğer malzemeler kullanılabilir
Pipetleyiciyi tekrarlayın	Eppendorf Belediyesi	4982000020	Diğer eşdeğer malzemeler kullanılabilir
Mikrosetrifüj	Herhangi bir marka		Herhangi bir marka kullanılabilir
Buzdolabı, 2-8°C	Herhangi bir marka		Herhangi bir marka kullanılabilir
girdap	Herhangi bir marka		Herhangi bir marka kullanılabilir
Derin dondurucu, -20 C	Herhangi bir marka		Herhangi bir marka kullanılabilir
Su banyosu, 37° C	Herhangi bir marka		Herhangi bir marka kullanılabilir, ancak su sirkülasyonunu kapatmak veya sirkülasyon yapmayan bir su banyosu kullanmak önemlidir çünkü su akışı pıhtı oluşumunu etkileyecek ve yanlış negatif sonuçlara yol açacaktır

Serisi edin Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi