$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Test kiti plakasının aktivasyonu
- Her bir oyuka 200 μl aktivasyon solüsyonu (kit ile elde edilir) ekleyerek 96 oyuklu filtreyi (mavi CPH-ksilen içeren) tahlil kit plakasını (Malzeme Listesi) aktive edin, ardından çalkalama olmadan oda sıcaklığında 10 dakika inkübasyon yapın.
- Mevcut aktivasyon solüsyonunu çıkarmak için bir vakum manifoldu (ara blok içinde ve toplama plakası olarak herhangi bir standart, şeffaf 96 oyuklu plaka ile) kullanarak vakum uygulayın. Bu adım için vakum manifoldu yerine 10 dakika boyunca 2.700 x g'da bir santrifüj kullanmak da mümkündür.
- CPH alt tabakalarını 100 μl steril su ekleyerek yıkayın ve stabilizatörü çıkarmak için bir vakum (veya merkezkaç kuvveti) uygulayın. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın ve plakalar artık kullanıma hazırdır.
2. Enzim reaksiyonu
NOT: Negatif kontrol olarak her zaman tek başına tamponu ve mümkünse daha önce karakterize edilmiş enzimleri pozitif kontrol olarak dahil edin. İstatistiksel olarak uygun sayıda çoğaltma kullanın. CPH substratları pH 3.0 ila 10.0 arasında stabildir ve her bir oyuktaki tampon ucu enzim çözeltisinin toplam hacmi 180 μl'yi geçmemelidir. Saflaştırılmış enzim çözeltisi yerine bitki özü veya kültür suyu da kullanılabilir.
- Tahlil kiti plakasının her bir oyuğuna 150 μl 100 mM sodyum asetat tamponu, pH 4.5 ve 5 μl endo-selülaz çözeltisi (1 U/ml'lik nihai konsantrasyona kadar) ekleyin.
- Çalkalama sırasında reaksiyon plakasından herhangi bir olası sızıntıyı toplamak için ürün plakasını (mikrotitre plaka okuyucu ile uyumlu şeffaf kuyulu bir plaka) tahlil kiti plakasının altına yerleştirin.
- Test kiti plakasını 25 °C'de 30 dakika boyunca 150 rpm'de yatay bir çalkalayıcıda inkübe edin.
NOT: İnkübasyon sırasında reaksiyonun tahlil kit plakasında karıştırılması, tutarlı ve tekrarlanabilir bir sonuç elde etmek için çok önemlidir. CPH substratları 90 °C'ye kadar stabildir. Bilinmeyen enzim konsantrasyonları içeren kültür suları CPH substratları ile test edilirken inkübasyon süresi 24 saate kadar arttırılmalıdır. Uygun inkübasyon sürelerinin enzim(ler)in aktivitesine bağlı olduğunu unutmayın, ancak genel olarak, 24 saat içinde tespit edilebilir bir aktivite yoksa, enzimin test edilen substratı bozmaması muhtemeldir. Aktif bir enzim, CPH substratının çözünmeyen kromojenik polisakkaritlerini, renkli süpernatan olarak görülebilen çözünür kromojenik oligosakkaritlere indirgemektedir.
- Temiz ürün plakasını, ara parça bloğu içeride olacak şekilde vakum manifoldunun içine yerleştirin.
- Tahlil kiti plakasını üstüne yerleştirin ve bir vakum uygulayın (maksimum negatif basınç -60 kPa). 2.700 x g'da bir santrifüjü 10 dk.
için kullanmak da mümkündür
NOT: Reaksiyon ürünü olarak renkli oligosakkaritleri içeren süzüntü, daha fazla analiz için artık ürün plakasındadır.
3. Algılama ve Miktar Tayini
- Görsel inceleme ile ürün plakasının her bir oyuğundaki sıvı hacminin yaklaşık olarak aynı olduğunu kontrol edin.
- Bir plaka okuyucu kullanarak mavi CPH-xylan için 595 nm'de toplama plakasının absorbansını okuyun.
- Veri analizi yaparken, yalnızca tampon negatif kontrol değerlerini, bir enzimin eklendiği kuyucuklardan gelen değerlerden çıkarın. Çoğaltılan kuyulardan ortalama değeri ve ortalamaların (SEM) standart hatasını hesaplayın.