Çözünmeyen Kromojenik Biyokütle Bazlı Enzim Taraması: Bitki Biyokütlesini Parçalayan Enzimlerin Bozunma Aktivitesini Değerlendirmek İçin Bir Test

Özet

Kaynak: Schückel, J., et al. Yeni Çözünmeyen Kromojenik Substrat Test Kitleri Kullanılarak Karbonhidrat Parçalayıcı Enzimlerin Yüksek Verimli Taraması. J. Vis. Uzm. (2016).

Bu videoda, çözünmeyen kromojenik biyokütle veya ICB kullanılarak bitki biyokütlesindeki kompleks polisakkaritlerin parçalanmasında etkili olan enzimlerin taranması için bir test gösterilmektedir. Enzimler, çözünür boyaya bağlı oligosakkaritleri serbest bırakmak için ICB'yi hidrolize eder ve enzim aktivitesi, reaksiyon ürününün kolorimetrik analizi ile değerlendirilir.

Protokol

1. 96 Kuyucuklu Formatta ICB Substratları ile Kromojenik Test

1. Enzim reaksiyonu
   1. 150 μl 100 mM sodyum asetat tamponu, pH 4.5 ve 5 μl 31 U/ml endo-ksilanaz solüsyonunu, kırmızı ICB-buğday samanı içeren tahlil kiti plakasının her bir oyuğuna ekleyin (kuyucuktaki son enzim konsantrasyonu: 1 U/ml).
      not: Tahlil kiti plakaları (ICB substratları içeren 96 oyuklu filtre plakaları) literatürde açıklandığı gibi üretilmiştir (bkz. ICB substratları, pH 3.0 ila 10.0 arasında bir pH aralığına sahip tamponlarda stabildir. Negatif kontrol olarak her zaman tek başına tamponu, pozitif kontrol olarak ticari enzimleri dahil edin ve istatistiksel olarak uygun sayıda kopya kullanın.
      1. CPH substrat plakası gibi ICB substratlarını etkinleştirmeyin, ancak 100 μl su ile üç kez yıkayarak ve ardından vakumlu filtrasyon veya santrifüjleme yaparak stabilizatörü çıkarın.
   2. Çalkalama sırasında alt tabaka plakasından herhangi bir olası sızıntıyı toplamak için ürün plakasını alt tabaka plakasının altına yerleştirin.
   3. Reaksiyonu 25 ° C'de inkübe edin, 150 rpm'de 2 hr.
      not: Aktif bir enzim, ICB substratındaki çözünmeyen kromojenik polisakkaritleri, renkli süpernatan olarak görülebilen çözünür oligosakkaritlere indirgemektedir. ICB substratları 90 °C'ye kadar stabildir. Kültür suyu gibi saflaştırılmamış enzimler kullanılıyorsa, inkübasyon süresi 24 saate kadar arttırılmalıdır.
   4. Ürün plakasını, ara blok içerideyken vakum manifoldunun içine yerleştirin.
   5. Tahlil kiti plakasını üstüne yerleştirin ve vakum uygulayın (maksimum negatif basınç -60 kPa) veya ürünü tahlil kiti plakasından ürün plakasının kuyusuna süzmek için bir santrifüj kullanın.
      not: Reaksiyon ürünü olarak renkli oligosakkaritleri içeren süzüntü, daha fazla analiz için şimdi toplama plakasındadır.

2. Algılama ve niceleme

1. Toplama plakasının her bir oyuğundaki sıvı hacminin görsel inceleme ile yaklaşık olarak aynı olduğunu kontrol edin.
2. Bir plaka okuyucu kullanarak kırmızı ICB-buğday samanı için 517 nm'de toplama plakasının emiciliğini okuyun.
3. Veri analizi yaparken - tamponu çıkarın - sadece bir enzimin eklendiği kuyucuklardan gelen değerlerden negatif kontrol değerleri. Çoğaltılmış kuyulardan ortalama değeri ve ortalamaların standart hatasını (SEM) hesaplayın.
   not: Bilinmeyen enzimlerin taranması durumunda, enzimin aktivitesinin dinamik aralığı hakkında daha ayrıntılı veri elde etmek için bir seyreltme serisi yapmanızı öneririz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Tahlil kiti plakaları	Glikoz lekesi		Özelleştirilmiş tahlil kiti plakaları
Vakum manifoldu için 350 ml alıcı plaka ara bloğu	Pall Şirketi	5015	Ara parça bloğu
96 oyuklu MultiScreen YG filtre plakası, 0,45 μm, şeffaf, steril olmayan	Kırlangıç	MSHVN4510	Tahlil plakası
96 Kuyucuklu Mikroplakalar, Polipropilen	Greiner Bio-Bir	651201	Alt tabakaları yıkadıktan sonra toplama plakası
Nunc MicroWell 96 Kuyulu Mikroplakalar	Termo Bilimsel	269620	Ürün plakası
Diyaframlı pompa MZ 2 NT	Vacuubrand	732000	Vakum manifoldu ile birlikte kullanılan vakum pompası
Bilgiler HT Ecotron	Bilgiler HT	4950132 (Buch ve Holm)	Yatay çalkalayıcı
Spektrum Max M5	Moleküler Cihazlar	10067-750 (VWR)	96 kuyulu plaka absorbans okuyucu
Vakum manifoldu	Pall Şirketi	5017	Vakum manifoldu
endo-β-1,4-ksilanaz M4 (Aspergillus niger)	Megazyme (Megazyme)	E-XYAN4	Ksilanaz [ksil]