Diferansiyel Nükleer Boyama Deneyi: Promidyum İyodür ve Hoechst Çift Boyama ile Mitokan Sitotoksisitesini Belirlemek İçin Bir Test

Özet

Kaynak: Pei, J. et al., Mitocan sitotoksisitesinin doğru belirlenmesi için Otomatik Diferansiyel Nükleer Boyama Testi. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu video, mitokanın ilaca duyarlı kanser hücreleri ve sağlıklı varyantlar üzerindeki sitotoksik etkisini tespit etmek için bir nükleer boyama yöntemini göstermektedir. Promidyum iyodür ve Hoechst boyası gibi DNA bağlayıcı boyalarla yapılan çift boyama, ölü ve canlı hücreler arasında net bir ayrım sağlar, böylece ilacın sitotoksisitesinin değerlendirilmesine yardımcı olur.

Protokol

1. Sitotoksisite Testi: Kurulum

1. Uygun ortamda (serumsuz veya% 1, 2.5 veya% 5 FBS RPMI-1640) istenen konsantrasyonlarda ilgilenilen bileşiklerin çözeltilerini hazırlayın.
   1. Tek bir bileşiğin sitotoksisitesini ölçmek için (ör., etkili dozları belirlemek için), bileşikleri 2x nihai konsantrasyonda hazırlayın.
   2. Bileşik kombinasyonlarının sitotoksisitesini ölçmek için, bileşikleri 4x nihai konsantrasyonda hazırlayın.
   3. Aynı miktarda çözücüyü uygun ortamla karıştırarak yalnızca çözücü kontrolleri hazırlayın. Örneğin, DMSO ve metanol içinde çözünmüş bileşikleri test ediyorsanız, her çözücü için yalnızca çözücü kontrolü yapın.
2. Hücreleri kültür kabından veya şişeden 15 mL'lik konik bir tüpe toplayın.
3. 10 μL hücre süspansiyonunu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 10 μL% 0.4 tripan mavisi ile boyayın. Her hücre kaynağı için canlı ve cansız hücreleri saymak için bir hemositometre kullanın.
4. 5 dakika boyunca 200 g'da pelet hücreleri. Aspirat veya dekant süpernatanı.
5. Hücre peletini teste uygun ortamda (serumsuz veya 1, 2.5, %5 FBS RPMI-1640) 3 * 10⁵ hücre / mL.
   hücre yoğunluğunda yeniden süspanse edin NOTLAR 1: 3*10⁵ hücre/mL hücre yoğunluğu, 15.000 hücre/kuyu tohumlama yoğunluğu sağlar. Tohumlama yoğunluğu önemli bir parametredir ve ideal olarak deneyden önce önceden tanımlanmalıdır. Tohumlama yoğunluğu şunları dikkate almalıdır: 1) hücre boyutu – genellikle daha büyük hücreler daha düşük bir yoğunlukta ekilir; 2) tedavi süresi – hücreler tipik olarak daha uzun sürecek deneyler için daha düşük bir yoğunlukta ekilir ve 3) hücre bölünme hızı – daha yüksek bölünme oranına sahip hücreler daha düşük bir yoğunlukta ekilir. Optimize edilmiş tohumlama yoğunluklarının özel örnekleri: K562 hücreleri, daha büyük, 24 saat süre – 10.000 hücre/kuyu; MOLM-13 hücreleri, orta büyüklükte, 24 saat tedavi – 15.000 / kuyu; MOLM-13 hücreleri, 48 saatlik tedavi – 8.000/kuyu; küçük sağlıklı periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler), 24 saatlik tedavi – 50.000 / kuyu; birincil AML hücreleri, 24 saatlik tedavi - 15.000-20.000 / kuyu.
   NOTLAR 2: FBS'nin ortamdaki varlığı, bileşiklerin aktivitesini etkileyebilir. FBS konsantrasyonunun azaltılması, tahlil sonuçlarının yorumlanmasını kolaylaştırabilir, ancak aynı zamanda fizyolojik doğruluğu da azaltır.
6. Çok kanallı bir pipet kullanarak 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna adım 1.5'ten 50 μL hücre süspansiyonu tohumlayın.
7. Bileşikleri aşağıdaki gibi ekleyin:
   1. Tek bileşik tahliller için, her bir oyuğa 50 μL 2x bileşik çözelti ekleyin. Solvent kontrol kuyuları için, 2x konsantrasyonda solvent içeren 50 μL test ortamı ekleyin.
   2. Kombinasyon tahlilleri için, her bir oyuğa bileşiklerin her birinden (4x çözelti) 25 μL ekleyin. Tek bileşik kontrol kuyuları için 25 μL 4x bileşik çözelti ve 25 μL test ortamı ekleyin. Solvent kontrol kuyuları için, 50 μL test ortamı veya solvent içeren test ortamı ekleyin.
      NOTLAR 1: DMSO'nun nihai konsantrasyonu% 0.5.
      'yi geçmemelidir NOTLAR 2: Bileşikleri içeren ortamın, düşük hacim nedeniyle pipet her bir kuyucuğun duvarına değecek şekilde eklenmesi önerilir.
8. Kuyucuk içeriğinin karışmasını sağlamak için plakaya hafifçe vurun.
9. Plakaları 37 ° C'de nemlendirilmiş% 5 CO₂ atmosferinde uygun bir süre, örneğin 24 saat inkübe edin.

2. Sitotoksisite Deneyi: Hoechst 33342 ve Propidium İyodür ile Boyama

1. 10x boyama çözeltisi hazırlayın. Bu çözeltinin her deneyden önce taze olarak hazırlanması gerekir, saklanamaz. Nihai boya konsantrasyonları deneyden önce belirlenmelidir.
   1. Lösemi hücre hatları ve birincil lösemi hücreleri için, 1 mL 10x boyama tamponu, steril PBS'de 10 μL 20 mM Hoechst 33342 ve 50 μL 1 mg / mL propidyum iyodür içerir (son konsantrasyonlar: Hoechst 33342 20 μM, PI 5 μg / mL).
   2. Sağlıklı PBMC'ler için, 1 mL 10x boyama tamponu, steril PBS'de 10 μL 20 mM Hoechst 33342 ve 10 μL 1 mg/mL propidyum iyodür içerir (nihai konsantrasyonlar: Hoechst 33342 20 μM, PI 1 μg/mL).
      not: Probidyum iyodürün nihai konsantrasyonu deneylerden önce belirlenmelidir. Hücreler bir dizi PI konsantrasyonu (1, 2.5, 5 μg / mL) kullanılarak test edilmeli ve daha sonra Hoechst / PI tarafından hesaplanan canlılık, tripan mavisi ile ölçülen canlılık ile karşılaştırılmalıdır. Yukarıda listelenen PI konsantrasyonları, ortam kontrol kuyularındaki hedef hücre canlılığına göre seçilmiştir (lösemi hücre hatları için ~% 90'ın üzerinde, sağlıklı PBMC'ler için ~% 70'in üzerinde).
      Dikkat: Hoechst 33342 ve propidyum iyodür potansiyel kanserojendir. Bunları tutarken uygun kişisel koruyucu ekipman giyin.
2. İnkübasyondan sonra, her bir oyuğa 10 μL 10x boyama tamponu eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın.
   not: Çapraz kontaminasyonu önlemek için pipet uçlarının ortama temas etmediğinden emin olun.
3. Kabarcıkları karıştırmak ve temizlemek için plakaya hafifçe vurun. 37 °C'de 15 dakika boyayın.
4. Tüm hücreleri plakanın dibine getirmek için plakayı 200 g'da 4 dakika santrifüjleyin. Görüntülemeyi engelleyecek lifleri ve/veya kalıntıları temizlemek için plakanın altını nemli bir kimwipe ile dikkatlice silin.
   NOTLAR 1: Plakanın santrifüjlenmesi, tüm hücrelerin görüntüde yakalanması için en yüksek şansı sağlar. Genellikle ölü hücreler ayrılır ve yüzer, bu da yanıltıcı sitotoksisite değerleri sağlar. Santrifüjleme bu etkiyi azaltır.
   NOTLAR 2: Plaka, santrifüjlemeden sonra mümkün olan en kısa sürede, ideal olarak 15 dakika içinde görüntülenmelidir. Santrifüjleme, PI boyamanın seçiciliğini azaltabilir ve hücrelerin propidyum iyodürü yavaşça biriktirmesine izin verebilir. Ölü hücrelerin görselleştirilmesiyle elde edilen doğruluktaki iyileşme, PI boyamasındaki hafif artıştan daha ağır basar

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
2-Deoksi-D-glikoz / 2-DG	Kimya-İmpeks	50-519-067
3-bromo-piruvat	Alfa Aesar	1113-59-3
96 kuyulu plakalar	Greiner Bio-Bir	655090	Siyah veya şeffaf düz tabanlı 96 oyuklu plakalar
Kontes II otomatik hücre sayacı	Termo Balıkçı
Cytation 5 Hücreli Görüntüleme Çok Modlu Okuyucu	BioTek
Hoechst 33342	Termo Balıkçı	62249	20 mM çözelti; son konsantrasyon 1:1.000
HyClone fetal sığır serumu	GE Sağlık	# 25-514
m-klorofenilhidrazon / CCCP	Sigma Aldrich	C2759
PBS tabletleri	Termo Balıkçı	BP2944100	1 tablet + 200 mL steril su = 1x PBS çözeltisi
Penisilin-Streptomisin-Glutamin (100X)	Gibco (Gibco)	10378016
Propidyum İyodür	Termo Balıkçı	50-596-072	Kuru toz; PBS'de 1 mg / mL stok; son konsantrasyon 5 μg / mL (lösemi hücreleri), 1 μg / mL (normal PBMC'ler)
Rotenon	Ark Ecz	AK115691
RPMI-1640 Ortamı L-glutamin ve sodyum bikarbonatlı, sıvı, steril filtreli, hücre kültürüne uygun	Sigma Aldrich	R8758-500ML
Tripan mavisi lekesi (% 0.4)	Gibco (Gibco)	15250-061
Hücre hatları
K562	ATCC (Uzay Servisi)	CCL-243	KML hücre hattı
MOLM-13	ATCC (Uzay Servisi)		AML hücre hattı
KÖSTEBEK-4	ATCC (Uzay Servisi)	CRL-1582	TÜM hücre hattı
OCI-AML2	ATCC (Uzay Servisi)		AML hücre hattı

Teknolojisi · Serisi . · Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi