İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Tam kandan eritrosit izolasyonu
- Asit sitrat dekstroz (ACD) içinde (4 ° C'de saklanır) 500 μL tam kanı bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin.
not: ACD'de tam kan satın alındı. Şirkete göre, 7 mL tam kana (8,5 mL toplam hacim) 1,5 mL ACD eklenir.
- Tam kanı oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 700 x g'da santrifüjleyin ve kırmızı eritrosit tabakasını terk etmek için bir pipet kullanarak berrak plazmayı ve ince kabarık kaplamayı çıkarın.
- 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgS04, 32 mM HEPES, 5 mM glikoz ve 1 mM CaCl2 içeren 1 L Ringer çözeltisi hazırlayın. 2 μL damla 1.0 M NaOH ekleyerek pH'ı 7.4'e ayarlayın. Glikoz içermeyen bir Ringer çözeltisi hazırlamak için aynı protokolü izleyin, ancak çözeltiye glikoz dahil etmeyin.
- Hücre peletini 1.5 mL Ringer çözeltisi içinde süspanse ederek, RT'de 5 dakika boyunca 700 x g'da santrifüjleyerek ve süpernatantı çıkararak eritrositleri 2x Ringer çözeltisinde yıkayın.
- 10 mL.
'lik bir nihai hacme ulaşmak için 40 μL eritrosit peletini 9.960 μL glikoz içermeyen Ringer çözeltisinde yeniden süspanse ederek %0.4'lük bir hematokrit yapın
not: Hematokrit, süspansiyondaki eritrositlerin hacim fraksiyonunu ifade etmek için kullanılan bir terimdir. % 0.4 hematokrit,% 0.4 eritrosit içeren bir süspansiyondur.
- Hücre süspansiyonunu 7 gün boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
2. Eritrositlerin iyonomisin ile tedavisi ve hemoliz ölçümü
- 2 mM'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için 1 mg iyonomisin kalsiyum tuzunu 630 μL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözün. Aliquot ve -20 °C'de saklayın.
- Adım 1.5'ten %0.4 hematokritin 1 mL'sini alın ve 1 μM'lik nihai konsantrasyona ulaşmak için 0.5 μL 2 mM iyonomisin ekleyin. 37 ° C'de 2 saat inkübe edin.
- Negatif kontrol olarak iyonomisin tedavisi olmadan 1 mL hematokrit kullanın.
- İyonomisin ile tedavi edilmiş ve tedavi edilmemiş hematokritleri RT'de 5 dakika boyunca 700 x g'da santrifüjleyin ve hücre peletlerini tüplerin dibinde bırakmak için süpernatantlarını çıkarın.
- Hücre peletlerini 1.5 mL Ringer çözeltisi içinde süspanse ederek, RT'de 5 dakika boyunca 700 x g'da santrifüjleyerek ve süpernatanları atarak hücreleri 3x Ringer çözeltisi ile yıkayın.
- Hemolizi ölçmek için, adım 1.5'ten 1.4 mL tedavi edilmemiş% 0.4 hematokrit bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin ve hemoliz için negatif kontrol olarak (% 0) 37 ° C'de 2 saat inkübe edin.
- Adım 1.5'ten 1 mL tedavi edilmemiş% 0.4 hematokrit bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin ve RT'de 5 dakika boyunca 700 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücre peletine 1 mL damıtılmış su ekleyin ve hemoliz için pozitif kontrol olarak (% 100) 37 ° C'de 2 saat inkübe edin.
- Adım 2.2'den 1 mL iyonomisin ile tedavi edilmiş% 0.4 hematokrit bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin.
- İşlenmemiş hücreleri, işlenmiş hücreleri ve hücreleri damıtılmış suda 700 x g'da RT'de 5 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanların 200 μL'sini alın ve 96 oyuklu bir plakaya ekleyin.
- Bir mikroplaka okuyucu kullanarak absorbansı 541 nm'de ölçün.
- Denklem 1:
kullanarak hemolizi hesaplayın
%Hemoliz = (A T - A0)/(A100 - A0)*100
buradaA 0, Ringer çözeltisindeki eritrositlerin emilimidir, A100, eritrositlerin sudaki emilimidir veA T, tedavi edilmiş eritrositlerin iyonomisin tarafından emilmesidir.
