Ek V Bağlanma Testi: Fosfatidilserin Etiketleme Yoluyla Apoptotik Eritrositleri Tanımlamak için Floresan Bazlı Bir Teknik

Abstract

Kaynak: Bigdelou, P., et al. Kalsiyum İyonofor Kullanılarak Kırmızı Kan Hücrelerinde Eriptoz İndüksiyonu. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu videoda, floresan Annexin V boyama kullanarak eritoz, eritrosit programlanmış hücre ölümü derecesini ölçmek için Annexin V bağlanma testini gösteriyoruz. Apoptotik eritrositler, hücre zarının iç kısmından dış broşürüne fosfatidilserin translokasyonu gösterir ve florofor etiketli Annexin V'nin translokasyonlu fosfatidilserine bağlanmasına ve böylece bir floresan sinyali yaymasına neden olur.

Protocol

İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Annexin-V bağlama deneyi

1. 2 mM'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için 1 mg iyonomisin kalsiyum tuzunu 630 μL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözün. Aliquot ve -20 °C'de saklayın.
2. % 0.4 hematokritten 1 mL alın ve 1 μM'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için 0.5 μL 2 mM iyonomisin ekleyin. 37 ° C'de 2 saat inkübe edin.
3. İyonomisin ile muamele edilmiş ve tedavi edilmemiş hematokritleri RT'de 5 dakika boyu....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Annexin V Alexa Fluor 488 - apoptoz kiti	Balıkçı Bilimsel	A10788	4 °C'de saklayın
BD FACSAria II akış sitometresi	BD Biyolojik Bilimler	643177
İyonomisin kalsiyum tuzu	EMD Milipore A.Ş.	407952-1 MG	2 mM'ye ulaşmak için DMSO'da çözün. -20 °C'de saklayın
merkezkaç	Kırlangıç Sigma	M7157	Modeli: Eppendorf 5415C
Tek kullanımlık yuvarlak alt akışlı sitometri tüpü	VWR (VWR)	VWRU47729-566
CaCl2	Balıkçı Bilimsel	C79-500
DPBS (DPBS)	VWR Yaşam Bilimleri	SH30028.02
Mikrosantrifüj tüpü	Balıkçı Bilimsel	02-681-5
ACD'de tam kan	Zen-Biyografi		Kullanmadan önce 4 °C'de saklayın ve 37 °C'ye kadar ısıtın