$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Annexin-V bağlama deneyi
- 2 mM'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için 1 mg iyonomisin kalsiyum tuzunu 630 μL dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözün. Aliquot ve -20 °C'de saklayın.
- % 0.4 hematokritten 1 mL alın ve 1 μM'lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için 0.5 μL 2 mM iyonomisin ekleyin. 37 ° C'de 2 saat inkübe edin.
- İyonomisin ile muamele edilmiş ve tedavi edilmemiş hematokritleri RT'de 5 dakika boyunca 700 x g'da santrifüjleyin ve hücre peletlerini tüplerin dibinde bırakmak için süpernatantlarını çıkarın.
- Hücre peletlerini 1.5 mL Ringer çözeltisi içinde süspanse ederek, RT'de 5 dakika boyunca 700 x g'da santrifüjleyerek ve süpernatanları atarak hücreleri 3x Ringer çözeltisi ile yıkayın.
- İyonomisin ile muamele edilmiş ve muamele edilmemiş eritrosit hücre peletlerini 1 mL 1x bağlayıcı tampon içinde yeniden süspanse edin.
- 1x bağlama tamponu elde etmek için 5x annexin V bağlayıcı tamponun 2 mL'sini 8 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde seyreltin.
- Bağlayıcı tamponda 235 μL hücre süspansiyonu alın ve 15 μL Annexin V-Alexa Flour 488 konjugatı ekleyin.
- Hücreleri karanlık bir yerde 20 dakika oda sıcaklığında (RT) inkübe edin. RT'de 5 dakika boyunca 700 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
- Hücre peletini 1.5 mL bağlayıcı tampon içinde süspanse ederek, RT'de 5 dakika boyunca 700 x g'da santrifüjleyerek ve süpernatanı çıkararak hücreleri 2x bağlama tamponu ile yıkayın.
- Akış sitometrisi ölçümleri için hücre peletlerini 250 μL 1x bağlayıcı tamponda yeniden süspanse edin.
2. Akış sitometrisi
- 200 μL annexin V ile boyanmış eritrositleri akış sitometrisi ile uyumlu 1 mL yuvarlak tabanlı polistiren tüplere aktarın.
- Akış sitometrisi yazılımına giriş yapın ve yeni deney düğmesine tıklayın. Yeni tüp düğmesine tıklayın. 488 nm'lik bir uyarma dalga boyu ve 530 nm'lik bir emisyon dalga boyu ile floresan yoğunluğunu ölçmek için global sayfayı seçin ve uygulanan analizi seçin.
- Floresanla etkinleştirilen hücre sıralama (FACS) analizi için toplanacak hücre sayısını 20.000 olarak ayarlayın.
- İstediğiniz tüpü seçin ve yükle düğmesine tıklayın. İleri saçılma ve yan saçılma ölçümleri için kayıt düğmesine tıklayın. Tüm numuneler için tekrarlayın.
- Numune düğmesine sağ tıklayın ve sonuç dosyasını oluşturmak için toplu analiz uygula'ya tıklayın.
- Numune düğmesine sağ tıklayın ve FSC dosyaları oluştur'a tıklayın.