$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
NOT: Okuyucular için uygun bir referans noktası olarak, aşağıdaki metodoloji, 20 deney örneğinden Fe biyoyararlanımının ölçümü için gerekli olan özel kültür koşullarını ve malzemelerini ve ayrıca bir biyo-tahlil çalışmasında gerekli kalite kontrollerini açıklamaktadır. Biyo-tahlil içindeki çeşitli hücre kültürü ve in vitro sindirim adımları için gereken süre nedeniyle numune sayısının bu kapasitenin üzerine çıkarılması önerilmez.
1. Numune miktarını seçme
- Katı veya sıvı gıdalar için, test edilecek numuneyi temsil ettiği kabul edilebilecek bir gıda miktarı belirleyin.
- Bir fasulye çeşidinden Fe biyoyararlanımını test ederken, 100-150 g fasulye tohumu kullanın ve bu miktarı homojen bir numuneye işleyin.
- Güçlendirilmiş meyve suları, süt ürünleri ve spor içecekleri gibi sıvı numuneler için, numune almadan önce gıdanın iyice karıştırıldığından emin olun.
NOT: Yukarıda belirtilen fasulye tohumu materyali miktarı, bu temel mahsulün tohumları arasındaki doğal farklılıkları hesaba katmak için önemlidir.
2. Numunelerin hazırlanması
- İşlemeden önce herhangi bir gıda numunesindeki kiri ve tozu damıtılmış-deiyonize su ile durulayın.
- Pişirme yöntemi ve öğütme gibi deneysel hedeflere göre uygun miktarda numuneyi işleyin.
NOT: Yemek pişirmek ve işlemek için, potansiyel bir kirletici Fe kaynağı olmayan pişirme kapları ve ekipmanlarının kullanılması çok önemlidir. Paslanmaz çelik ekipman kirletmez; bununla birlikte, taş değirmen öğütücüler, dökme demir pişirme kapları ve Fe içeren paslanmaz çelik olmayan herhangi bir ekipman gibi ekipmanlar önemli miktarda kirletici Fe ekleyebilir. Öğütme için genellikle standart bir paslanmaz çelik kahve değirmeni yeterlidir.
- Liyofilize edin ve homojen bir toz haline getirin.
NOT: Homojenize edildikten sonra araştırmalar, ölçülen her gıda için üç bağımsız analiz tekrarının yeterli olduğunu göstermiştir.
- Numune homojenliğinin elde edilmesi zorsa, ürünün formülasyonunu veya işlenmesini gözden geçirin. Bu mümkün değilse, homojenlik şiddetli değilse çoğaltmalar ekleyin.
- Homojen katı gıdaların çoğu için, kopya başına 0,5 g liyofilize numune kullanın. Gerekirse, replikat başına 1,0 g'a kadar numune kullanın, ancak 0,5 g'dan fazlasının yanıt derecesinde bir fayda sağlayıp sağlamadığını kontrol edin.
NOT: 0,5 g'dan daha yüksek miktarlarda katı gıda diyaliz membranını tıkayabilir (aşağıya bakınız).
- 1-2 mL sıvı numune kullanın.
not: Liyofilizasyon genellikle sıvı numuneler için gerekli değildir.
3. Caco-2 hücre kültürü
- Stok kültürleri
- Caco-2 hücrelerini sertifikalı bir tedarikçiden satın alın.
- 25 mM HEPES (pH 7.2),% 10 (h / h) fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 antibiyotik-antimikotik çözeltisi ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium'unu (DMEM) kullanarak% 5 CO2 hava atmosferine (sabit nem) sahip bir inkübatörde 37 ° C'de stok şişelerinden hücreleri kültürleyin.
- Yeterli hücre mevcut olduğunda, genellikle 7-10 günlük kültürden sonra, hücreleri kollajen kaplı olmayan şişelerde 30.000 hücre /cm2 yoğunlukta tohumlayın.
- Çok kuyulu plakaları tohumlamak için mevcut ve gerekli olan hücre sayısına bağlı olarak şişe boyutunu seçin.
NOT: Genel olarak, T225 (225 cm2) şişeleri, biyo-tahlil başına 11 çok kuyulu (6 oyuklu; 9.66 cm2/oyuklu) plakanın (numune karşılaştırmaları için 10 plaka, kalite kontrolleri için 1 plaka) kullanıldığı deneyler için en iyi sonucu verir.
- Hücreleri 7 gün boyunca şişelerde büyütün, ortamı iki günde bir değiştirin ve 7. günde çok kuyulu plakaları tohumlamak için kullanın.
NOT: Hücrelerin stok kültüründen başlatıldığı ve daha sonra bir dizi deneyde kullanıldığı andan itibaren 10-15 geçişten fazla olmayan bir geçiş aralığının kullanılması önerilir. Hücre kültürü pasajları sınırlı olmalıdır, çünkü geniş bir pasaj aralığı hücre hattında adaptif değişikliklere ve dolayısıyla modelin yanıtında değişkenliğe neden olabilir.
- Çok kuyulu plakalarda hücre kültürü
- Caco-2 hücrelerini 50.000 hücre/cm2 yoğunlukta 6 oyuklu kollajen kaplı plakalarda tohumlayın.
NOT: Bu adım genellikle Çarşamba günü yapılırsa en iyi sonucu verir. Aşağıdaki adımlar, haftanın bu gününün neden en uygun olduğunu açıkça ortaya koyacaktır.
- 25 mM HEPES (pH 7.2), %10 (h/h) FBS ve %1 antibiyotik-antimikotik solüsyon ile desteklenmiş DMEM kullanarak %5 CO2 hava atmosferine (sabit nem) sahip bir inkübatörde hücreleri 37 °C'de 12 gün boyunca büyütün.
NOT: Hücre tek katmanlarının 12 günden daha uzun süre kültürlenmesi, hücrenin aşırı büyümesine neden olabilir. Önceki araştırmalar, bu koşullar altında, tohumlamadan 12 gün sonra, hücre tek tabakasının olgunlaştığını, plakaya iyi bir şekilde bağlandığını ve yanıt tutarlılığında optimal olduğunu açıkça göstermiştir. Hücrelerin 19-21 güne kadar daha uzun süre büyümesi, hücrelerin aşırı büyümesine neden olur ve ortam, besinlerde hızla tükenir ve sağlıksız tek tabakalara neden olur.
- 12 günlük süre boyunca, ortamı tutarlı bir günlük programda en az 2 günde bir değiştirin.
- Tohumlamadan sonraki 12. günde, kültür ortamını 10 mM BORULAR (piperazin-N,N'-bis-[2-etansülfonik asit],% 1 antibiyotik-antimikotik çözelti, hidrokortizon (4 mg / L), insülin (5 mg / L), selenyum (5 μg / L), triiyodotironin (34 μg / L) ve epidermal büyüme faktörü (20 μg / L) ile desteklenmiş 2 mL Minimum Esansiyel Ortam (MEM [pH 7]) ile değiştirin.
NOT: Tohumlama Çarşamba günü başlatıldıysa, 12. gün Pazartesi olacaktır.
- Ertesi gün (yani 13. gün), MEM'i çıkarın ve 1 mL MEM (pH 7) ile değiştirin.
NOT: Bu adım Salı günü gerçekleşir. Bu, biyotahlilin başladığı gündür; Bu nedenle, 13 günlük program, tutarlı bir haftalık programın avantajını sağlar ve biyo-tahlilin aynı hafta içi gün içinde tutarlı bir şekilde yürütülmesine olanak tanır.
4. İn vitro sindirim
- Geçme halkalarının hazırlanması
- Asitle yıkanmış diyaliz membranı ile donatılmış bir silikon O-ring kullanarak sterilize edilmiş bir ekleme halkası oluşturun (Şekil 1A).
NOT: Biyo-tahlil gününün 1 gün öncesinden (yani Pazartesi, 12. gün) ekleri hazırlayın ve kullanıma hazır olana kadar 4 ° C'de 18 MΩ suda saklayın.
- Biyotahlil gününde (Salı, 13. gün), ekleri buzdolabından çıkarın, boşaltın ve suyu 0,5 M HCl ile değiştirin. Kullanmadan önce en az 1 saat laminer akış başlığında oda sıcaklığında bırakın.
NOT: Bu adım, MEM'i kültür plakalarından çıkarmadan önce yapılmalıdır. Membranın asitle yıkanması, olası kirletici Fe'yi uzaklaştırmaya yarar ve geçme halkasını ve membranı sterilize eder.
- 0,5 M HCl'yi eklerden boşaltın ve steril 18 MΩ su ile durulayın. Steril 18 MΩ suda, oda sıcaklığında laminer akış başlığında kullanıma hazır olana kadar saklayın.
- Caco-2 hücreli 6 oyuklu plakaların her bir oyuğuna bir halka yerleştirin, böylece iki odacıklı bir sistem oluşturun. Plakaları eklerle birlikte inkübatöre geri koyun.
NOT: Bu adım, her bir kuyucuğa taze 1.0 mL MEM eklendikten hemen sonra yapılmalıdır (bkz. Adım 3.2.5.).
- Pepsin çözeltisinin hazırlanması
- Deney günü, 0.145 g pepsini 50 mL 0.1 M HCl'de çözerek pepsin çözeltisini hazırlayın. Çözeltiyi oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir platform çalkalayıcı üzerinde hafifçe çalkalayın.
- Pankreatin-safra çözeltisinin hazırlanması
- Deneyle aynı gün, 2.1 gNaHCO3'ü 250 mL 18 MΩ suda çözerek 0.1 M NaHCO3 hazırlayın.
- 0.35 g pankreatin ve 2.1 g safra ekstraktını 175 mL 0.1 M NaHCO3 içinde karıştırın.
- Pankreatin ve safra özütü çözündürüldükten sonra, 87.5 g zayıf bir katyon değişim reçinesi ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve oda sıcaklığında 30 dakika çalkalayarak karıştırın.
- Bulamacı büyük bir sütuna dökün ve elüatı toplayın.
- Kolonu 70 mL ilave 0.1 MNaHCO3 ile elute edin ve bu hacmi pankreatin safra çözeltisine toplayın.
NOT: Reçinenin amacı, pankreatin-safra ekstraktlarında yaygın olarak bulunan kirletici Fe'yi uzaklaştırmaktır.
- İn vitro sindirimi başlatın.
- Numuneyi steril 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde (polipropilen) tartın, ardından pH 2'de 140 mM NaCl ve 5 mM KCl içeren 10 mL fizyolojik salin ilavesi yapın.
- Numuneye 0,5 mL hazırlanmış domuz pepsin solüsyonu ekleyerek mide sindirim işlemini başlatın ve 37 ° C'de 1 saat boyunca düşük, yumuşak bir ayarda sallanan bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
- Bu süreyi takiben, 1,0 MNaHCO3 ile pH'ı 5,5-6,0'a ayarlayarak her numunenin bağırsak sindirim sürecini başlatın.
- Her numune tüpüne 2,5 mL pankreatin-safra çözeltisi ekleyin ve pH'ı 1,0 M NaHCO3 ile 6,9-7,0'a ayarlayın.
- PH ayarlandıktan sonra, 140 mM NaCl, 5 mM KCl (pH 6.7) çözeltisi kullanarak her bir tüpteki hacmi eşitleyin ve tüpün ağırlığını 15 g.
hedef değerle ölçün
NOT: Bazı gıdalar için, gıdaların tamponlama kapasitesine bağlı olarak toplam hacmin 16 g veya 17 g'a getirilmesi gerekebilir.
- Her bağırsak sindiriminin 1.5 mL'sini, Caco-2 hücrelerini içeren 6 oyuklu kültür plakasının karşılık gelen bir kuyusunun üst odasına (yani diyaliz membranı ile ekleme halkasını içeren) aktarın (Şekil 1B).
- Plaka kapağını değiştirin ve 37 °C'de (%5 CO2 hava atmosferi) 6 salınım/dk'da sallanan bir çalkalayıcı üzerinde 2 saat inkübe edin.
- Sindirimle birlikte ekleme halkasını çıkarın ve her oyuğa ek 1 mL MEM (pH 7) ekleyin.
- Hücre kültürü plakasını 22 saat daha inkübatöre (37 °C; %5 CO2 hava atmosferi) geri koyun.
- 22 saat sonra, hücre kültürü ortamını çıkarın ve hücre tek tabakasına 2.0 mL 18 MΩ su ekleyin.
NOT: Su, hücreleri ozmotik olarak parçalayacaktır.
- Sonraki hücre proteini ve hücre ferritin analizleri için tüm hücre lizatını standart polipropilen mikrosantrifüj tüplerine veya benzerine hasat edin.
