$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
NOT: Tüm işlemler, üfleyici açık ve ışıklar kapalıyken sınıf II biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır.
1. Malzemelerin hazırlanması
NOT: Tüm malzemeler Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.
- Ortam 1, santrifüjleme Ortamı 2 ve floresan 2-deoksi-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoksadiazol-4-il) amino]-D-glikoz (2-NBDG veya FD-glikoz) saklama ve çalışma çözeltilerini hazırlayın. Kaputun altındaki tüm ışıkları kapatarak FD-glikozu deney boyunca ışıktan koruyun.
- Kullanıma hazır hücre kültürü reaktifleri kullanın: Tripsin-EDTA, fosfat tamponlu salin (PBS) ve glikoz içermeyen ve fenol kırmızısı içermeyen Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamı (bundan böyle glikoz içermeyen DMEM olarak anılacaktır).
- 20 mL radyoimmünopresipitasyon testi (RIPA) lizis tamponu kullanın.
NOT: İlerleyen bölümlerde, insülin stimülasyonu olan ve olmayan 3T3-L1 fibroblastlarda hücre dışı tükenme ve farklı FD-glukoz dozlarının hücre içi alımı karşılaştırılmıştır (Şekil 1).
2. 3T3-L1 hücre kültürü ve bakımı
- Kültür 3T3-L1 fare fibroblastları, iki 96 oyuklu plakada 20 mL Orta 1 içinde seyreltilmiş 1 x 106 hücre kaplayarak. Plaka her kuyucuk başına 100 μL hücre süspansiyonu, karıştırarak bu süspansiyonun homojenliğini korumasını sağlar. Hücreleri 37 ° C'lik bir inkübatörde (% 5 CO2 ve% 95 nem) 48 saat boyunca, yaklaşık% 70 -% 80 birleşene kadar ortamı değiştirmeden büyütün.
- Hücreleri 48 saat boyunca aynı ortamda kültürleyerek birleşen ve aç tutun. İstenilen açlık katabolik durumuna bağlı olarak inkübasyon süresini 24-72 saat arasında değiştirin.
3. 3T3-L1 hücrelerinin açlıktan ölmesi
- 96 oyuklu plakalardaki hücrelerden ortamı boşaltın. Kalan sıvıyı steril kağıt havlu kullanarak emdirin.
- 96 oyuklu plakayı oyuk başına 100 μL PBS ile durulayın ve kalan sıvıyı steril kağıt havlularla emdirin.
- Oyuk başına 100 μL glikozsuz DMEM ekleyin ve 40 dakika inkübe edin. Hücre tipine, uyaranlara ve istenen açlık seviyesine bağlı olarak inkübasyon süresini ayarlayın.
NOT: Kuluçka süresi mevsime bağlı olarak optimizasyon gerektirebilir.
4. Farklı konsantrasyonlarda FD-glikoz çözeltilerinin hazırlanması
NOT: Şekil 1'deki deney, insülin ile stimülasyonu olan ve olmayan hücre dışı ve hücreler arası ortamları inceler.
- Her stimülasyon koşulu için sekiz kopya (96 oyuklu bir plakada bir sıra) kullanın. Bu nedenle, her stimülasyon koşulu için 1 mL hazırlayın (Tablo 2 ve aşağıda belirtilmiştir).
- İnsülin olmadan sekiz stimülasyon koşulu kullanın: 2.5 μg / mL, 1 μg / mL, 0.5 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.1 μg / mL, 0.05 μg / mL ve 0 μg / mL (FD-glikoz olmadan kontrol) bir 96 oyuklu plakada.
- İnsülin ile sekiz stimülasyon koşulu kullanın (10 μg / mL, son konsantrasyon): 2.5 μg / mL, 1 μg / mL, 0.5 μg / mL, 0.2 μg / mL, 0.1 μg / mL, 0.05 μg / mL ve 0 μg / mL (FD-glikoz olmadan kontrol) başka bir 96 oyuklu plakada.
- Stimülasyon koşullarını hazırlamak için, 1 mL çalışma stoğu çözeltisi (1:1000 seyreltme veya 5 μg / mL) elde etmek için 1 μL 5 mg / mL FD-glikoz çalışma solüsyonunu (Tablo 1) 999 μL glikoz içermeyen DMEM içinde seyreltin.
- Bu çalışma stoğu çözeltisini kullanarak, ışıksız bir biyogüvenlik kabininde deneylerden hemen önce 2 mL'lik tüplerde 2.5 μg/mL, 1 μg/mL, 0.5 μg/mL, 0.2 μg/mL, 0.1 μg/mL ve 0.05 μg/mL elde etmek için 1:2000, 1:5000, 1:10.000, 1:25.000, 1:50.000 ve 1:100.000 FD-glikoz dilüsyonları hazırlayın (Tablo 2).
- Adım 4.4'ü tekrarlayın ve yukarıda belirtilen koşulların her birine 1 μL insülin (10 mg / mL, son konsantrasyon) ekleyin.
NOT: Bu örneklerdeki nihai insülin konsantrasyonu 10 μg/mL = 1.7 nmol/mL'dir. Homojenizasyonu sağlamak için, diğer çözeltileri eklemeden önce tüplere insülin ekleyin.
5. Aç 3T3-L1 hücrelerini tedavi etmek
- 40 dakikalık inkübasyondan sonra, glikoz içermeyen DMEM'i her bir oyuktan 96 oyuklu plakalarda boşaltın ve kalan sıvıyı steril kağıt havlularla emdirin.
- Yukarıda açıklanan çeşitli tedavi koşullarından her biri bir sütun boyunca kuyucuklara 100 μL (kuyu başına) ve aynı tedavi koşulundan 100 μL (kuyu başına) her iki 96 oyuklu plakadaki sıra boyunca kuyucuklara (sekiz kopya) ekleyin. İnsülinli ve insülinsiz koşulları kullanan plakaları etiketleyin. Kontrol kuyucuklarına tek başına glikoz içermeyen DMEM ekleyin (n = 8).
- Plakayı karanlıkta bir hücre kültürü inkübatöründe (37 ° C,% 5 CO2 ve% 95 nem) 40 dakika inkübe edin.
6. Uyarılmış 3T3-L1 hücreleri için hücre dışı ve hücreler arası ölçümler
- Hücreler 40 dakika boyunca uyarıldıktan sonra, stimülasyon ortamını her iki plakadan aynı deney düzenini koruyarak yeni 96 oyuklu plakalara aktarın.
- Steril kağıt havlular üzerindeki hücrelerle orijinal uyarılmış 96 oyuklu plakalardan kalan herhangi bir çözeltiyi boşaltın.
- İsteğe bağlı olarak, hücreleri PBS ile yıkayın. PBS'yi çıkarın ve kalan solüsyonu steril kağıt havlular üzerinde boşaltın.
- Her kuyucuğa 100 μL RIPA lizis tamponu ekleyin. İsteğe bağlı olarak, proteinleri korumak için RIPA tamponuna proteaz inhibitörü ekleyin. RIPA içeren plakaları 30 dakika boyunca bir çalkalayıcıya yerleştirin.
- Bir mikroplaka okuyucu (Malzeme Tablosu) kullanarak, sırasıyla 485 ve 535 nm'lik uyarma (Ex) ve emisyon (Em) dalga boylarında, önce hücre dışı FD-glikoz içeren ortamda ve daha sonra 30 dakikalık inkübasyonun sonunda RIPA parçalanmış hücrelere sahip plakada floresan ölçün (bkz. adım 6.4).
Tablo 1: Kültür ortamının ve FD-glikoz çözeltilerinin hazırlanması.
| Çözüm/Ortam | Bileşen |
| Etanol: DMSO (1: 1 / v / v) | 1-1.5 mL'lik tüpte etanol (200 μL) ve DMSO (200 μL); hücre kültürü dereceli etanol ve DMSO kullanın |
| Orta 1 | Steril 50 mL'lik tüpte DMEM (89 mL), Penisilin/streptomisin (%1) (1 mL) ve Buzağı serumu (%10) (%10) |
| Santrifüj Ortamı 2 | Steril 50 mL'lik tüpte DMEM (89 mL), Penisilin/streptomisin (%1) (1 mL) ve Sığır serumu (%10) (%10) |
| Depolama FD-glikoz çözeltisi 5 mg / mL (14.5 mM) | FD glikoz (1 mg) ve Etanol: DMSO (1: 1 / v / v) (200 μL) 0.5 mL tüpte; -80 ° C'de, tercihen argon veya nitrojen atmosferi altında saklayın |
| Çalışma FD-glikoz çözeltisi 5 μg/mL (14.5 mM) | Depolama FD glikoz çözeltisi 5 mg / mL (1 μL), Glikozsuz DMEM (999 μL); deneyden hemen önce hazırlayın. |
Tablo 2: Şekil 1'de gösterilen deneyler için farklı konsantrasyonlarda FD-glikoz çözeltilerinin hazırlanması.
adet
adet
adet
adet
| Seyreltme | kontrol | 1:2x103 | 1:5x103 | 1:1x104 | 1:2.5x104 | 1:5x104 | 1:1x105 |
| Konsantrasyon (μg/mL) | 0 | 2,5 | 1 | 0,5 | 0,2 | 0,1 | 0,05 |
| Glikoz içermeyen DMEM (μL) | 1000 | 500 | 800 | 900 | 960 | 980 | 990 |
| FD Glikoz 5 μg/mL (μL) | 0 | 500 | 200 | 100 | 40 | 20 | 10 |
