Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
NOT: Tüm işlemler, üfleyici açık ve ışıklar kapalıyken sınıf II biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır.
1. Malzemelerin hazırlanması
NOT: Tüm malzemeler Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.
- Ortam 1, santrifüjleme Ortamı 2 ve floresan 2-deoksi-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoksadiazol-4-il) amino]-D-glikoz (2-NBDG veya FD-glikoz) saklama ve çalışma çözeltilerini hazırlayın. Kaputun altındaki tüm ışıkları kapatarak FD-glikozu deney boyunca ışıktan koruyun.
- Kullanıma hazır hücre kültürü reaktifleri kullanın: Tripsin-EDTA, fosfat tamponlu salin (PBS) ve glikoz içermeyen ve fenol kırmızısı içermeyen Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamı (bundan böyle glikoz içermeyen DMEM olarak anılacaktır).
2. Organlarda hücre dışı FD-glukoz tükenmesinin ex vivo ölçümü
- Fareleri, organ diseksiyonundan önce glikoz metabolizmasını uyaran bileşiklerle aşağıdaki gibi ön tedavi edin.
- Dokuz haftalık Lepob erkek fareleri kullanın (n = 11). Deneyden önce tüm fareleri düzenli bir chow diyeti ile besleyin.
- İntraperitoneal (i.p.) enjeksiyonlar için fareleri rastgele üç gruba atayın.
- Kontrol Lepob grubundan farelere 0.1 mL steril PBS (n = 4) enjekte edin.
- İnsülin Lepob grubundan farelere, vücut ağırlığının gramı başına 12 IU insan insülini içeren 0.1 mL steril PBS enjekte edin (n= 3).
- AAC2 Lepob grubundan farelere, vücut ağırlığının gramı (BW) başına 0.1 nmol AAC2 içeren 0.1 mL steril PBS enjekte edin (n = 4).
- 15 dakika sonra, fareleri anestezi uygulanmış hayvanlardan kardiyak ponksiyon ile% 5 izofluran ve kan ekshalasyonuna maruz bırakın.
- Her hayvandan viseral epidimal beyaz yağ dokusunu (200 mg), karaciğeri (200 mg) ve tüm beyni inceleyin. Doku işleme için Sınıf II biyogüvenlik başlığı kullanın.
- Işıksız bir Sınıf II Biyogüvenlik kabininde glikoz içermeyen DMEM'de FD-glikoz (0.29 mM) çalışma solüsyonu hazırlayın.
- Bir mikroplaka okuyucu kullanarak sırasıyla 0.29 ve 485 nm'lik uyarma ve emisyon dalga boylarında FD-glikoz çalışma çözeltisinin (535 mM) floresansını ölçün.
- Hasat edilen dokuları / organları PBS içeren 6 oyuklu bir plakada 1 dakika inkübe edin. Her doku veya organı ayrı bir kuyuda tutun.
- 1 dakika sonra, PBS'yi emmek için her bir mendili steril bir kağıt havlu üzerine koyun. Dokuları / organları 4.000 μL glikoz içermeyen DMEM içeren ayrı bir 6 oyuklu plakaya aktarın ve 2 dakika inkübe edin.
- 2 dakika sonra, dokuları çıkarın ve 0.29 mM FD-glikoz çalışma çözeltisi (1 mL / oyuk) içeren 6 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına aktarın. Dokuları içeren 6 oyuklu plakaları FD-glikoz çalışma solüsyonunda 37 ° C'de (% 5 CO2 ve% 95 nem) inkübe edin.
- Hücre dışı FD glikoz tükenmesinin kinetiğini analiz etmek için 0, 10, 20, 30, 40, 60, 90 ve 120 dakikalık inkübasyondan sonra her kuyucuktan 100 μL FD-glikoz çalışma çözeltisi toplayın. Toplamadan önce ve sonra çalkalayın.
- Bir mikroplaka okuyucu kullanarak sırasıyla 485 ve 535 nm'lik uyarma ve emisyon dalga boylarında floresanı ölçmek için 100 μL FD-glikoz çalışma solüsyonunu 96 oyuklu plakalara aktarın.
- Her hayvandaki her organ için floresansı 0 dakika değerine (%100) normalleştirin (Şekil 1).
Tablo 1: Kültür ortamının ve FD-glikoz çözeltilerinin hazırlanması.
| Çözüm/Ortam | Bileşen |
| Etanol: DMSO (1: 1 / v / v) | 1-1.5 mL'lik tüpte etanol (200 μL) ve DMSO (200 μL); hücre kültürü dereceli etanol ve DMSO kullanın |
| Orta 1 | Steril 50 mL'lik tüpte DMEM (89 mL), Penisilin/streptomisin (%1) (1 mL) ve Buzağı serumu (%10) (%10) |
| Santrifüj Ortamı 2 | Steril 50 mL'lik tüpte DMEM (89 mL), Penisilin/streptomisin (%1) (1 mL) ve Sığır serumu (%10) (%10) |
| Depolama FD-glikoz çözeltisi 5 mg / mL (14.5 mM) | FD glikoz (1 mg) ve Etanol: DMSO (1: 1 / v / v) (200 μL) 0.5 mL tüpte; -80 ° C'de, tercihen argon veya nitrojen atmosferi altında saklayın |
| Çalışma FD-glikoz çözeltisi 5 μg/mL (14.5 mM) | Depolama FD glikoz çözeltisi 5 mg / mL (1 μL), Glikozsuz DMEM (999 μL); deneyden hemen önce hazırlayın. |
